紫外分光光度法和荧光分析法ppt课件.ppt

一、紫外一、紫外—可见光分光光度法可见光分光光度法光谱分析法光谱分析法二、荧光分析法二、荧光分析法 基本原理基本原理仪器主要部件仪器主要部件主要应用主要应用基本原理¨概述：紫外概述：紫外-可见分光光度法是通过被测物可见分光光度法是通过被测物质在紫外质在紫外-可见光区的特定波长或一定波长可见光区的特定波长或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法主要用于药品的鉴别、定量分析的方法主要用于药品的鉴别、检查和含量测定检查和含量测定¨范围：范围：¨ 可见光区〔可见光区〔400~760nm）） 紫外光区〔紫外光区〔200~400nm））Beer-Lambort 定律*A为吸收度；*T为透光率；*E为吸收系数〔以 表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值）*c为溶液浓度；*l为样品总厚度适用条件：入射光为单色光入射光为单色光溶液是稀溶液溶液是稀溶液固体、固体、 液体和气体样品在同一波长液体和气体样品在同一波长下，各组分吸光度具有加和性下，各组分吸光度具有加和性仪器主要部件仪器主要部件单色器单色器光源光源检测器检测器吸收池吸收池信号显信号显示系统示系统光光光光 源源源源: : 常采用氘灯和钨卤灯常采用氘灯和钨卤灯常采用氘灯和钨卤灯常采用氘灯和钨卤灯 钨灯最适宜的使用波长范围为钨灯最适宜的使用波长范围为钨灯最适宜的使用波长范围为钨灯最适宜的使用波长范围为320320～～～～1000nm1000nm。

　　　　　　　　 氘灯能发出光的波长范围一般为氘灯能发出光的波长范围一般为氘灯能发出光的波长范围一般为氘灯能发出光的波长范围一般为190190～～～～400nm400nm单色器：棱镜或光栅单色器：棱镜或光栅单色器：棱镜或光栅单色器：棱镜或光栅吸收池：玻璃或石英吸收池吸收池：玻璃或石英吸收池吸收池：玻璃或石英吸收池吸收池：玻璃或石英吸收池检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器仪器分类§单光束紫外可见分光光度计§准双光束紫外可见分光光度计§双光束紫外可见分光光度计§双波长紫外可见分光光度计主要应用 利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。

1、药物的杂质检查2、药物的含量测定 如巴比妥类药物的含量测定〔巴比妥类药物在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构）、芳酸及其脂类药物含量测定、维生素A含量测定〔在325~328nm的波长范围内有最大吸收〕等三点校正法 本方法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光度校正值后，再计算含量其原理主要基于以下两点： ①杂质的无关吸收再310~340nm的波长范围内几乎呈一条直线，且随波长的增大吸光度下降 ②物质对光吸收呈加和性的原理，即在某一样品的吸收曲线上，各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和，因而吸收曲线也是二者吸收的叠加3、药物的鉴别 对比吸收光谱特征数据 对比吸收度〔或吸收系数〕的比值 对比吸收光谱的一致性 例苯磺舒：用含盐酸的乙醇[取盐酸溶液〔9-1000〕2ml，加乙醇制成100ml]制成没1ml中含20ug的溶液，在225nm与249nm的波长处有最大吸收，在249nm波长处的吸收度为0.67 甾体激素类药物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液〔20ug/ml），在239nm的波长处应有最大吸收，吸光度为0.57~0.60;在239nm与263nm波长处的吸光度比值应为2.25~2.45§1.判别物质的异构体，如互变异构体，顺反异构体，开链和成环异构体，旋光异构体，空间异构体等。

反式异构体空间位阻小，共轭程度较完全最大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数，大于顺式§2.推测物质的共轭体系和部分骨架§一般需与色谱，红外，质谱，波谱等多种仪器联合作物质的结构分析4.结构分析紫外分光光度测定方法§普通普通测定分光光度法定分光光度法 §1.单组分的分的测定定§ 通常采用通常采用 A-C 标准曲准曲线法定量法定量测定§2.多多组分的同分的同时测定定§ ⑴⑴若各若各组分的吸收曲分的吸收曲线互不重叠，互不重叠，则可在可在各自最大吸收波各自最大吸收波长处分分别进行行测定这本本质上与上与单组分分测定没有区定没有区别§ ⑵⑵若各若各组分的吸收曲分的吸收曲线互有重叠，互有重叠，则可根可根据吸光度的加合性求解据吸光度的加合性求解联立方程立方程组得出各得出各组分的含量分的含量§Aλ1= εaλ1bca ＋＋ εbλ1bcb §Aλ2= εaλ2bca ＋＋ εbλ2bcb 差示分光光度法差示分光光度法§普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差需采用示差法§ 即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液§设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs < cx)。

那么：§ Ax= εb cx As = εb cs§ ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc§ 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ：§ cx = cs + Δc 双波长分光光度法§不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高§ ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c§ 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度成正比§（例子：课本366页）导数分光光度法§导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性§ 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析：§ Ｉ＝Ｉ0 e-εbc§假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定：§ dI 0 /dλ＝0§那么：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ§ ＝－Ｉ0 bc dε/dλ§（例子：课本233页）其他§卡尔曼滤波法 §偏最小二乘法 §小波变换§三波长分光光度法 §系数倍率法§……与紫外与紫外-可见法异同点可见法异同点运用运用 原理原理原理 荧荧光光—分分子子吸吸收收电电磁磁波波后后，，从从其其最最低低激激发发态重新发射紫外线或可见光的现象态重新发射紫外线或可见光的现象 利利用用某某些些物物质质被被一一定定波波长长的的光光照照射射后后所所产产生生的的，，能能够够反反映映该该物物质质特特性性的的荧荧光光来来进进行行定性定量的分析方法定性定量的分析方法——荧光分析法。

荧光分析法在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC 光照光照 分子基态分子基态 激发态激发态 辐射跃迁辐射跃迁 荧光荧光 若光源是：若光源是： 由荧光波长可确定物质分子由荧光波长可确定物质分子 可见可见-紫外光源紫外光源 分子荧光分析法分子荧光分析法 具有结构具有结构 由由荧荧光光强强度度可可测测物质的含量物质的含量 原子特征光谱作光源原子特征光谱作光源 原子荧光分析原子荧光分析 X射线作光源射线作光源 X射线荧光分析射线荧光分析构件构件§光源光源 ：： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在强度较大的连续光谱，且在300nm～～400nm 范围范围内强度几乎相等，故较常用内强度几乎相等，故较常用 。

§激发单色器激发单色器 ：： 置于光源和样品室之间的为激发单置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱 §发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器筛单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器筛选出特定的发射光谱选出特定的发射光谱 §样品室：样品室： 通常由石英池通常由石英池(液体样品用液体样品用)或固体样品或固体样品架架(粉末或片状样品粉末或片状样品)组成 §检测器：检测器： 一般用光电管或光电倍增管作检测器一般用光电管或光电倍增管作检测器可将光信号放大并转为电信号可将光信号放大并转为电信号 荧光分析法与紫外荧光分析法与紫外-可见分析法异同点可见分析法异同点 荧光分析法与紫外荧光分析法与紫外-可见比较：可见比较： 均属于分子光谱均属于分子光谱 仪器构造仪器构造 基本相似基本相似 荧光荧光 可见可见-紫外紫外 本质本质 发射光谱发射光谱 吸收光谱吸收光谱 灵敏度灵敏度 10-10-10-12 g/ml 10-4-10-7g/ml 选择性选择性 高高 普通普通运用运用硫色素硫色素荧光法光法测定定维生素生素B1 维生素生素B1 在碱性溶液中被在碱性溶液中被铁氰化化钾氧氧化成硫色素，在紫〔化成硫色素，在紫〔365nm〕照射下呈〕照射下呈蓝色色荧光〔光〔435nm〕通〕通过与与对照品照品荧光光强度比度比较。

即可即可测得供得供试品含量〔品含量〔课本本260页））荧光分光光度法光分光光度法测定定维生素生素E 采用同步采用同步荧光光扫描法描法测定血清中定血清中维生生素素E，有效的消除溶，有效的消除溶剂拉曼光拉曼光谱的干的干扰，提，提高灵敏度和准确性高灵敏度和准确性课本本277页））§时间分辨分辨荧光光光光谱§基于不同基于不同发光体光体发光衰减速度不同光衰减速度不同. .寿寿命不同命不同. .在在进行行这种种测量量时要求要求带有有时间延延迟设备的脉冲光源和的脉冲光源和带有有门控控时间电路的路的检测器件器件, ,从而可在固定延从而可在固定延迟时间tdtd和和门控控时间tg,tg,用用发射射单色器色器进行行扫描描. .可得到可得到时间分辨分辨发射光射光谱§同步同步扫描描§根据激根据激发光和光和发射射单色器在色器在扫描描过程程中彼此中彼此间所保持的关系所保持的关系参考文献参考文献§刘文英，刘文英，药物分析物分析.§袁袁观宇，生物物理学宇，生物物理学.§李昌厚，紫外分光光度李昌厚，紫外分光光度计.§陈 伟,林新林新华.紫外紫外-可可见分光光度法新技分光光度法新技术在在药物分析中物分析中应用的用的进展展.Journal of Fujian Medical University .2019;35:300-303.§王　雷王　雷, 杨新建新建, 寇　欣寇　欣. 紫外分光光度法在中紫外分光光度法在中药分析中的分析中的应用用进展展. 天天津津药学学.2019;第第15卷第卷第5期期。