《基因的克隆方法》PPT课件.ppt

第三章第三章基因的克隆方法基因的克隆方法前言前言 基因基因是生物染色体上的是生物染色体上的一段一段DNADNA序列序列，具有转录、翻译成某种蛋白质，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能调控生物生命活动的功能2基基因因的的表表达达过过程程mRNAmRNA翻译成翻译成翻译成翻译成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质基因组基因组基因组基因组DNADNA3 3如何获得基因？如何获得基因？——即基因的克隆方法即基因的克隆方法 基于基于基因产物基因产物的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因加标签基因加标签的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因序列基因序列的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因图谱基因图谱的基因克隆方法的基因克隆方法4一、一、 基于基因产物的基因克隆方法基于基因产物的基因克隆方法mRNAmRNA翻译成翻译成翻译成翻译成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质1 1、根据、根据蛋白质序列蛋白质序列克隆目的基因克隆目的基因2 2、根据、根据基因表达差异（基因表达差异（mRNAmRNA））克隆基因克隆基因5 原理：根据蛋白质上的一段多原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库然后设计探针或引物从基因组文库或或cDNAcDNA文库中分离出相应的基因。

文库中分离出相应的基因1 1、蛋白质序列克隆法、蛋白质序列克隆法6实用性：实用性： 分离纯化蛋白质十分困难CysCys Met Asp Met Asp GluGlu Met Met LysLys ArgArg AsnAsn IleIleTGTTGTATGATGGACGACGAAGAAATGATGAAAAAAAGAAGAAACAACATAATA C C T T G GATGATG G G G G T T T T C C据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意！注意！密码子密码子有简并有简并性现象！性现象！72 2、根据基因表达差异（、根据基因表达差异（mRNAmRNA）克隆基因）克隆基因基因表达的差异表现：基因表达的差异表现：一是基因表达的种类的不同；一是基因表达的种类的不同；二是基因表达水平的改变二是基因表达水平的改变8  差减杂交（差减杂交（SHSH））  抑制性差减杂交抑制性差减杂交（（SSHSSH））  差异显示差异显示PCRPCR（（DD RT-PCRDD RT-PCR））  DNADNA代表性差异分析代表性差异分析（（DNA RDADNA RDA））  扩增限制性片段长度多样性（扩增限制性片段长度多样性（AFLPAFLP））  cDNAcDNA微阵列微阵列已发展的相应基因克隆方法：已发展的相应基因克隆方法：9  差减杂交（差减杂交（SHSH））n最早由最早由Lamar和和Palmer于于1984年提出并年提出并用于雄鼠用于雄鼠Y染色体的染色体的DNA研究。

研究超声波超声波打断雌鼠打断雌鼠的的DNA（（过量过量100倍）倍）(XX)MboI完全消化雄鼠完全消化雄鼠的的DNA (XY)变性、复性变性、复性去除共有序列去除共有序列BamHI酶切酶切表达载体表达载体连接、转化、测序分析连接、转化、测序分析缺点：技术要求高，耗时，工作量大缺点：技术要求高，耗时，工作量大NO.1NO.2NO.310SH在mRNA研究上的应用机理： !!不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限特异表达基因特异表达基因的样本（的样本（TS））无特异表达基因的无特异表达基因的无特异表达基因的无特异表达基因的样本（样本（样本（样本（RSRS））））提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CDNA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子11 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达； 基因时空表达的研究：如根、茎、叶； 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照差减杂交技术的应用方面差减杂交技术的应用方面：：121.2.2 抑制性差减杂交（抑制性差减杂交（SSH））Tester样本样本mRNADriver样本样本mRNASfiI AcDNAcDNASfiI BAB混合，变性杂交混合，变性杂交过量ABPCR扩增扩增5`3`13应用应用基因突变体的研究：如基因的表达与不基因突变体的研究：如基因的表达与不表达表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照肥与不施肥、光照与不光照141.2.3 差异显示差异显示PCR（（DD RT-PCR））最先由最先由Liang等于等于1992年报道，目前已广泛在年报道，目前已广泛在实验室使用。

实验室使用主要原理：利用真核生物主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有结尾处有POLY（（A））结构，在其结构，在其3`端设计象端设计象5`-T11GA样引物，该引物可样引物，该引物可与与mRNA总数的十二分之总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合时结合5`端的随机引物（端的随机引物（20条条10-mer），），可可以使不同长度的基因得到扩增以使不同长度的基因得到扩增5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA155`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT1617具体操作：具体操作：1、提取、提取mRNA；；2、特定引物（、特定引物（12分之一）反转录；分之一）反转录；3、特定引物和、特定引物和RP结合结合RT-PCR；；4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别带，从而找出差别DNA。

18缺点：缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测工作量大工作量大无法定量研究无法定量研究扩出的条带往往是扩出的条带往往是3`端比较短的端比较短的UTR区的一区的一段序列，提供的信息较少段序列，提供的信息较少19优点：优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成所需的所需的mRNA量量少各样本各样本mRNA的差异可同时进行比较的差异可同时进行比较扩出的扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等可直接用于测序、文库筛选等20二、基于基因加标签的基因克隆二、基于基因加标签的基因克隆方法方法原理：主要是在生物基因组中原理：主要是在生物基因组中插入插入外源的一段外源的一段DNA，，使生物体产生使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的段外源已知的DNA片段来克隆基片段来克隆基因的方法因的方法21外源外源DNA基因组染色体基因组染色体DNA基因基因A产生突变型产生突变型  分类：分类： T-DNA标签法标签法 转座子标签法。

转座子标签法22 T-DNA标签法克隆基因技术路线：标签法克隆基因技术路线：Ø农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体变性状的个体Ø建立突变体基因组文库及野生型基因组文库建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.Ø用用T-DNA片段做片段做probe筛选突变体文库，获得阳筛选突变体文库，获得阳性克隆Ø用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆野生型的阳性克隆Ø把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析23野生株野生株转基因株转基因株目的基因染色体T-DNA染色体T-DNA探针探针筛选转基因文库筛选转基因文库作探针筛选野生株基因文库作探针筛选野生株基因文库构建基因组文库基因苗构建基因组文库基因苗阳性克隆阳性克隆目的基因目的基因获得阳性克隆获得阳性克隆基因序列分析，基因序列分析，确定为基因确定为基因阳性克隆转化突变体，确定基因功能24转座子标签法转座子标签法 转座子又称转座因子或者跳跃因子转座因子或者跳跃因子，实际上也是DNA片段片段，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。

25转座子标签法转座子标签法u最早是美国玉米育种家最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被年发现，起初不被认同，认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同实后得到认同u根据根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族：的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统系统和和spm因子，后者如果蝇的因子，后者如果蝇的copia因子26转座子根据结构不同可以分为简单转座转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子子和复杂转座子ü简单转座子：可以直接插入到其他位置简单转座子：可以直接插入到其他位置,也也叫插入序列叫插入序列ü复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记结构共同点：结构共同点：ü两端含有两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列个核苷酸的倒置重复序列ü含有可编码转座酶的基因含有可编码转座酶的基因应用：以应用：以Ac/Ds系统为例系统为例27Ac/Ds系统操作原理把把Ac，，Ds分别转化并获得转化体分别转化并获得转化体把把Ac转化体同转化体同Ds转化体进行杂交得到转化体进行杂交得到F1代，然后自交得到代，然后自交得到F2、、F3代分离群体，代分离群体，找出稳定突变个体。

找出稳定突变个体用用Ds做做probe筛选突变体文库获得突变筛选突变体文库获得突变基因的部分序列基因的部分序列用上述序列筛选正常个体基因组文库或用上述序列筛选正常个体基因组文库或cDNA文库，得到目的基因文库，得到目的基因28三、三、 基于基因序列的基因克隆方基于基因序列的基因克隆方法法 根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因根据克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆克隆方法又可以分为两种形式：通过分子杂交克隆法和通过法和通过PCR扩增基因法扩增基因法291 1、、通过分子杂交克隆法原理：通过分子杂交克隆法原理： 根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分根据基因序列上的同源保守性，从一种生物中分离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基离获得的基因用于制作分子探针，从另一种生物的基因文库中分离出此生物中的同源基因因文库中分离出此生物中的同源基因301））直接从基因组中扩增过程：直接从基因组中扩增过程：（（1）提取基因组）提取基因组DNA作作模板模板（（2）根据目的基因序列）根据目的基因序列设计引物设计引物（（3））PCR扩增及产物鉴定扩增及产物鉴定2 2、、通过通过PCR扩增基因法原理：扩增基因法原理： 根据基因序列结构特征，设计基因特根据基因序列结构特征，设计基因特异引物，利用异引物，利用PCRPCR技术直接从生物的基因技术直接从生物的基因组或是组或是cDNAcDNA中扩增出目的基因。

中扩增出目的基因31提取基因组提取基因组DNAPCR引物设计引物设计真核生物基因组含有内含子！真核生物基因组含有内含子！此法适合扩增原此法适合扩增原核生物基因核生物基因PCR扩增扩增基因序列分析基因序列分析32（（1）提取基因组）提取基因组 total RNA（（2）反转录合成总）反转录合成总cDNA作模板作模板（（4））PCR扩增及序列分析扩增及序列分析（（3）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物2））从从mRNA中扩增中扩增: RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾适合扩增真核生物基因适合扩增真核生物基因334 、基于基因图谱的基因克隆方法又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因34染色体染色体染色体染色体分子标记分子标记分子标记分子标记A A分子标记分子标记分子标记分子标记B B目的基因目的基因目的基因目的基因阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆转化互补实验转化互补实验转化互补实验转化互补实验基因图位克隆示意图基因图位克隆示意图35图位克隆基因的一般操作过程：图位克隆基因的一般操作过程： 通过遗传分析构建与目标基因紧密通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。

的精细定位 用与目标基因紧密连锁的两侧分子用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记标记筛选基因组文库筛选基因组文库，构建包含目，构建包含目标基因的基因组物理图谱标基因的基因组物理图谱目的基因标记标记1标记标记2标记标记3标记标记4标记标记536染色体染色体染色体染色体分子标记分子标记分子标记分子标记2 2分子标记分子标记分子标记分子标记3 3目的基因目的基因目的基因目的基因基因组物理图谱基因组物理图谱进一步精细定位获得目的基因37 通过染色体步移或染色体登陆技术对通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆阳性克隆 对阳性克隆转化隐性受体进行功能互对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补 基因序列测定及表达分析等基因序列测定及表达分析等38影响基因图位克隆的因素：影响基因图位克隆的因素：ü建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小距离大小ü基因组的大小及可能存在的大量的重复序列基因组的大小及可能存在的大量的重复序列ü基因组文库的大小及单克隆的大小基因组文库的大小及单克隆的大小。

成功的例子：成功的例子：ü水稻水稻Xa21ü拟南芥的拟南芥的RPM1，，RPS2等39图位克隆基因需满足的条件：图位克隆基因需满足的条件：u较理想的遗传图谱和物理图谱，如较理想的遗传图谱和物理图谱，如SSR、、RFLP图谱u大片段的基因组文库（大片段的基因组文库（BAC ，，PAC ，，TAC等）u遗传转化技术遗传转化技术40其它的基因克隆法其它的基因克隆法cDNA捕捉法捕捉法RNAi：：RNA干涉法干涉法酵母双杂交法酵母双杂交法 41思考题思考题请简单阐述SH在mRNA水平上克隆差异表达基因的机理。