冷鲜猪肉中甲单胞菌分离及其鉴定方法.doc

冷鲜猪肉中假单胞菌分离及其鉴定方法一. 知识背景革兰氏染色机制：革兰氏染色反应与细菌细胞壁的化学组成和结构有着密切的关系目前大多 认为，经过染色和媒染之后，在细菌的细胞膜或细胞质上染上了结晶紫--腆的复 合物革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚，肽聚糖网层次多，交联度高，结构较紧密， 故用95%乙醇脱色时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，加上革兰氏阳性菌的细 胞壁基木上不含脂类，乙醇处理时不能在壁上溶岀缝隙因此，结晶紫--碘复合 物仍被牢牢的阻留在细胞壁以内，使菌体呈现紫色反之，革兰氏阴性菌的细胞 壁较薄，肽聚糖层薄，交联度低，结构疏松，用乙醇来处理的时候，肽聚糖网孔 不易收缩同时，由于革兰氏阴性菌的外壁层脂类含量较高，当乙醇将脂类溶解 后，细胞壁上就会出现较大缝隙为使其通透性增大，所以结晶紫--碘复合物就会 被溶出细胞壁这时再用番红等红色染液进行复染，这可使革兰氏阴性菌发细胞 壁呈现复杂的红色，而革兰氏阳性菌则仍然呈现紫色涂布T板法英文名为spread plate method,由于将食菌材料现加到还较烫的 培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平台法也会使一 些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究 中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。

徒步平板法分离:由于需要分离的菌种是假单胞菌，所以选择的培养基只要实验室通用的牛肉 膏蛋白胨培养基（简称普通肉汤培养基），先将己溶化的培养基倒入无菌平皿， 制成无菌平板，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻 璃涂布棒将菌液均匀分散至整个平板表而，如果稀释得当，在平板表而就可出现 分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖起来形成的挑取单个 菌落经移植培养或重复以上操作多次，即可获得纯培养由于用涂布分离法主要缺点是涂布物问题和菌落重叠问题，所以我们要运用初步的鉴定，再取儿个细菌进行初步的鉴定假单胞菌是冷鲜猪肉中主要的腐败菌，属于细菌类，是一类革兰阴性菌，需 氧，冷藏低温下能迅速生长假单胞菌是直或微弯杆菌，单个，卵圆到短杆，有 的长杆，极生鞭毛，可运动少数种不运动菌苔不明显呈色，可产生水溶性色素 化能有机营养型，需氧，在自然界分布广某些菌株具有很强的分解脂肪和蛋白 质的能力可在食品表面迅速生长，一般产生水溶性色素，氧化产物和粘液，引 起食品产生异味及变质，很多在低温下能良好地生长，所以是冷藏食品腐败变质 的主要原因如荧光假单胞菌仔低温不可使牛肉，牛乳及乳制品腐败，腐败假单 胞菌可使鱼，牛奶及乳制品变质，可使牛奶的表面出现污点。

主要用途为生产维 生素C,抗生素和多种酶等所以，在有氧冷藏条件下，假单胞菌可导致一些肉制品，乳制品，水产品等 高蛋G含量的食品腐败变质，影响产品和货架期，造成经济损失，因此对假单胞 菌的检测显的及其重要二. 报告目的通过此次的报告，能更加深入的了解细菌的结构及其基本特征，并且通过自 学学习到细胞的分离技术及对细菌的鉴定方法，也学习到了革兰氏染色机制，并 且会运用此机制来进行细菌的鉴定并通过此次的报告学4到更多的食品微生物 学技术三. 报告思路通过查找有关文献及资料了解假单胞菌，在大概知道了假单胞菌之后，在通 过书木上的知识进行假单胞菌的详细了解利用假单胞菌的微生物学特性进行分 离及培养，在利用书本上关于革兰氏染色的机制和与氧化酶的生化反应为阳性来 确定是否为假单胞菌1!假单胞菌的特性:假单胞菌(Pseudomonas)为革兰氏阴性菌，直或微弯的杆状好氧性细菌， 无芽孢，以极生鞭毛运动，有少数种不运动假单胞菌属分布很广，在水、污水、 土壤和空气中均存在，有的种对人、动物或植物有致病性假单胞菌常常是导致 肉品腐败的优势菌，假单胞菌属的焚光假单胞菌(Ps.fluorescens)、莓实假单胞 菌（Ps.fragi）、隆德假革胞菌（Ps.lundensis）是最重要的肉制品腐败菌种。

分离微生物菌种的初步鉴定:1. 通过群体形态观察，获取单一纯种在划线或稀释等培养后的平板上，挑取形态与FI的菌相同大小的单一菌落移 接至固体斜面培养基，待做初步鉴定和保种用2. 细胞形态观察通过显微镜对细胞个体形态特征的观察，可以较方便地识别不同种类的微生 物3. 细胞染色观察对形态上难以区分的微生物，通过细胞染色手段进行鉴别例如，革兰氏染 色反应就是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法它是通过细菌细胞壁的化学组 成不同而分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌某些细菌兵有芽孢，荚膜，鞭毛和 异染颗粒等特殊结构，可利用特殊的染色法进行鉴别4. 生理生化性能鉴定生化反应通常用来鉴别在形态方面不易区别的微生物它是根据各类微生物 体内的酶系统和代谢产物的不同，通过生化反应测定微生物的代谢产物进而鉴 别例如，糖发酵实验，甲基红实验，吲哚实验等5. 生存环境测试每种微生物都有自己最佳的生存条件，包括温度，酸碱度，氧，渗透压等 将每个条件做一系列梯度，培养待鉴定菌株，观察是否与目的菌相一致6. 生产性能测试分离得到的纯种微牛.物是否只有生产或所需的性能，必须进行性能测定后才 决定取舍性能测定的方法一般分为初筛和复筛两种。

在这里，我们首先进行形态上的鉴定，即有无鞭毛及其生长部位和数目，有 无芽孢和荚膜，芽孢的人小和位置，细菌细胞的构造，能否运动这些在运用显 微镜都能进行初步的鉴定，当然显微镜只能在菌种的分析鉴定上起到辅助作用 在对形态相对复杂的细菌，就需要其他的鉴定措施在进行初步的鉴定之后，我们可以根据（一）形态学特征细胞形态及其染色特性、菌落特征、特殊的细胞结构、运动性、等等 微生物分类和鉴定的重要依据之一：a） 易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊形态结构的细菌;b） 许多形态学特征依赖于多基因的表达，只有相对的稳定性；（二）生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关酶及蛋白质都是基因产物对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多 营养类型、酶、代谢产物等：生长温度、与氧、pH、渗透压的关系；宿主种类、与宿主的关系；免疫特性（三）核酸的碱基组成和分子杂交特点：与形态及生理生化特性的比较不 同，对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间 基因组的差异，因此结果更加可信经过这些检验鉴定之后，我们可以在根据其最大的特点，也就是我们书本上 讲的革兰氏染色，因为假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，所以我们可以利用这个特 性将其区别出来。

革兰氐染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师 Gram创立细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下 有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两人类，前者叫做革 兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）为观察方便，脱色后再用一 种红色染料如碱性蕃红等进行复染阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色有 芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧 菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反 应不一样现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据另外，阳性菌菌体等电 点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此 不易脱去，阴性菌则相反所以染色时的条件要严格控制例如，在强碱的条件 下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都 负反应此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫一碘复合物的通透性也不一致，阳性 菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。

所以脱色时间，脱色方法也 应严格控制革兰氏染色原理：G +菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱 水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上G 一菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高，乙 醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法 是:1） 涂片固定2） 草酸铵结晶紫染1分钟3） 自来水冲洗4） 加碘液覆盖涂面染1分钟5） 水洗，用吸水纸吸去水分6） 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分7） 蕃红染色液（稀）（或沙黄）染10秒钟后，自来水冲洗干燥，镜检 染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色在知道了是革兰氏阴性菌后，在运用生理生化反应来进行辨别假单胞菌属与 肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性莫拉菌属、产碱杆菌属等均为阳 性氧化酶试验:（1）原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶 此酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，然后此氧化型 细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

因此，本试验结果与细胞色素C 的存在有关2) 方法：取洁净滤纸条，沾取菌落少许，加氧化酶试剂(10g/L盐酸四甲基对苯 二胺水溶液或10g/L盐酸二甲基对苯二胺水溶液)1滴，lmin内观察结果也可 将试剂滴加到菌落上进行试验3) 结果：阳性者立即变粉红色，5-10s内呈深紫色无色为阴性4) 应用：用于奈瑟菌属的菌种鉴定，该属细菌均阳性此外，也用于假单胞菌 属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性莫拉菌属、产碱杆菌属等均 为阳性注意事项：①试验吋应避免接触含铁物质，以免出现假阳性②10g/L盐酸四甲 基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化 而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去 不用五.讨论1. 在分离鉴定冷鲜猪肉中假单胞菌的时候，有哪些干扰细菌？2. 在分离与培养的时候会出现菌落，试讨论细菌的细胞形态与菌落形态的相关 性O3..在进行革兰氏染色时出现的假阳性是什么原理?。