重组DNA表达系统课件(powerpoint 120页).pptx

重组重组DNADNA表达系统表达系统 体外表达：无细胞表达系统体外表达：无细胞表达系统 原核表达系统：大肠杆菌表达系统等原核表达系统：大肠杆菌表达系统等 体内表达：体内表达： 酵母表达系统酵母表达系统 真核表达系统真核表达系统 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 动物动物/植物表达系统（转基因动物植物表达系统（转基因动物/植物）植物） 体系选择体系选择研究基因功能研究基因功能: 大大肠肠杆杆菌菌, 裂裂殖殖酵酵母母,昆昆虫虫细细胞胞, CHO细细胞胞多肽药物生产多肽药物生产: 大大肠肠杆杆菌菌, 毕毕氏氏酵酵母母, CHO细细胞胞, 乳乳腺腺组组织织疫苗疫苗: 大肠杆菌大肠杆菌, 酵母酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产单抗生产: 杂交瘤细胞杂交瘤细胞工业酶生产工业酶生产: 各种微生物各种微生物 一、体外表达系统（无细胞表达系统）一、体外表达系统（无细胞表达系统）v体体外外翻翻译译系系统统又又称称无无细细胞胞蛋蛋白白质质合合成成系系统统，是是一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统一种相对胞内表达系统而言的开放型表达系统。

l优点：内源型优点：内源型mRNA干扰很小，操作程序简单，获干扰很小，操作程序简单，获得重组蛋白周期很短主要用于蛋白质快速分析鉴得重组蛋白周期很短主要用于蛋白质快速分析鉴定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间的相互定；基因转录和翻译调控机理研究；分子间的相互作用的研究作用的研究l缺点：缺点： 昂贵；昂贵； 操作要求高；操作要求高； 表达量不够高表达量不够高 主要的体外表达系统：主要的体外表达系统：1、兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备兔网织红细胞系统，由新西兰大白兔制备2、麦麦胚胚提提取取物物系系统统，可可稳稳定定地地表表达达一一些些在在兔兔网织红细胞中翻译受到抑制的网织红细胞中翻译受到抑制的DNA 3、原原核核体体外外翻翻译译系系统统（S30原原核核体体外外翻翻译译系系统统）， E.coli S30提提取取物物由由OmpT内内切切酶酶和和Lon蛋蛋白白酶酶缺缺陷陷的的E.coli B菌菌株株制制备备，所所以以在在S30系统中表达基因可以增加产物的稳定性系统中表达基因可以增加产物的稳定性目前多家公司有商业化产品，常见的有：目前多家公司有商业化产品，常见的有：lRTS E.Coli 系统系统;lRTS100 wheat germ CECF系统系统 (Roche)lTNT快速偶联转录快速偶联转录/翻译系统翻译系统 (Promega)；lGold TNT T7 Express 96系系统统 （Promega），该该系系统统有有SP6和和T7两两种种类类型型，适适合合在在96孔孔板板上上进进行行大大规规模高通量筛选分析；模高通量筛选分析； lTNT T7 Quick for PCR DNA (promega)，PCR DNA 的的TNT T7快快速速系系统统从从PCR反反应应液液中中直直接接取取样样，无无需需纯纯化化DNA，直直接接用用于于偶偶联联的的转转录录/翻翻译译反反应；应； l TNT 偶联小麦胚芽抽提系统偶联小麦胚芽抽提系统 (promega)。

二、原核表达系统二、原核表达系统v特点：产量高、生长速度快、操作容易、成本低 v缺点：l翻译后加工修饰体系不完善：无糖基化、酰基化等l一般表达获得的蛋白常常以变性状态存在，不具有生物学活性 （一）大肠杆菌表达系统（一）大肠杆菌表达系统v目前较常用的表达载体是具有可诱导的T7启动子的表达载体，大部分蛋白均可获得表达而且表达量较高，表达量可占细菌总蛋白的25以上lT7RNA聚合酶来源于T7噬菌体，期活性高于大肠杆菌RNA聚合酶很多倍，而且较少发生转录中止l它只识别自己的启动序列，不能启动大肠杆菌DNA的转录，对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性，因而可在利福平存在的条件下，使目的基因得到大量扩增l正常大肠杆菌并不表达T7RNA聚合酶，为了能利用T7启动子表达外源基因，将T7RNA聚合酶基因置于lacUV5启动子控制下，整合到大肠杆菌染色体，构建了能被IPTG诱导表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株l常用宿主细胞有BL21（DE3）、JM109（DE3）等v还有受温度变化诱导的具有噬菌体PL启动子调控 的载体等 按蛋白质类型分按蛋白质类型分 单纯表达单纯表达单纯表达单纯表达: pJLA: pJLA系列系列系列系列, , 用用用用NcoI/NdeINcoI/NdeI导入导入导入导入AUGAUG的载体的载体的载体的载体 融合表达融合表达融合表达融合表达: : 融合各种融合各种融合各种融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etctag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达分泌表达分泌表达分泌表达: pel/ompT: pel/ompT分泌肽分泌肽分泌肽分泌肽按启动子分按启动子分 laclac及衍生的及衍生的及衍生的及衍生的tac , trc, pac, ractac , trc, pac, rac等启动子等启动子等启动子等启动子 IPTG IPTG诱导诱导诱导诱导 lamda phage Plamda phage PL L和和和和P PR R 启动子启动子启动子启动子 热诱导热诱导热诱导热诱导 T7 T7 启动子启动子启动子启动子 IPTG IPTG诱导诱导诱导诱导 T5 T5 启动子启动子启动子启动子 IPTG IPTG诱导诱导诱导诱导 araara启动子启动子启动子启动子 阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类常见的大肠杆菌商业化表达系统有：1、pET system and pETBlue system（Novagen公司），是原核蛋白表达中应用最多的系统。

具有可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌目前共有包括40多种载体、15种不同宿主菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关产品 l基本结构由T7启动子、核糖体结合位点、信号肽序列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗性基因核质粒复制位点等l有可以表达N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同质粒也可以表达非分泌性蛋白2、pBAD表达系统（Invitrogen公司），可控制蛋白质的生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值通过与硫氧还蛋白的融合来增加溶解度 3、QIAexpress Expression System（Qiagen公司 ）pJLA50X系列系列; pcDNAII; etcpET系列系列 (T7 promoter, Novagen(T7 promoter, Novagen公司公司公司公司) )pQE系列系列 (T5 promoter, Qiagen(T5 promoter, Qiagen公司公司公司公司) )pMAL系列系列 ( (周质表达周质表达周质表达周质表达, BioLabs, BioLabs公司公司公司公司) )pGEX系列系列 (GST(GST融合表达融合表达融合表达融合表达, Pharmacia, Pharmacia公司公司公司公司) )pBAD系列系列 (Arabinose (Arabinose诱导型诱导型诱导型诱导型) )常用表达载体常用表达载体pTYB系列系列 (CBD(CBD融合融合融合融合, , 可以自我切割可以自我切割可以自我切割可以自我切割, BioLabs), BioLabs) BL21(DE3)/pLysS :BL21(DE3)/pLysS : 自身表达自身表达自身表达自身表达T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase 适用适用适用适用pETpET系列等带系列等带系列等带系列等带T7T7启动子的载体启动子的载体启动子的载体启动子的载体 M15/SG13009 :M15/SG13009 : 自身表达自身表达自身表达自身表达T5 RNA polymeraseT5 RNA polymerase 适用适用适用适用pQEpQE系列等带系列等带系列等带系列等带T5T5启动子的载体启动子的载体启动子的载体启动子的载体 BL21TrxB(DE3) :BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase thioredoxin reductase 突变突变突变突变 Origami :Origami : thioredoxin reductase/glutathione thioredoxin reductase/glutathione reductase reductase 双突变双突变双突变双突变 适合带适合带适合带适合带thioredoxin reductasethioredoxin reductase的的的的融合表达载体融合表达载体融合表达载体融合表达载体, , 帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL:BR21CodonPlusRIL: 富含富含富含富含ATAT的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP:BR21CodonPlusRP: 富含富含富含富含GCGC的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株特殊的表达用菌株外源基因在原核细胞中的表达形式按表达蛋白的部位分： 分泌表达； 外周质及膜上表达 ； 胞内表达。

外源基因在原核细胞中的表达形式 在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型、非融合型 原则上应能够使外源基因表达效率高，蛋白质产量高，不易被细菌分解，而且产物易被提取、纯化 融合基因的表达 外源基因在大肠杆菌中表达的一种简便方法是使其表达为融合蛋白，也就是说要表达的外源基因连接在一段原核基因的下游，蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由外源DNA的完整序列编码，这样的蛋白质由1条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白融合蛋白的特点转录和翻译起始从正常的大肠杆菌序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白；融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定；产生的融合蛋白较大，容易从蛋白质凝胶电泳中区别出夹，而且融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻于燥，磨成粉末后即可作为抗原；有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外这有助于蛋白质的分离和纯化融合方式 6His Tag融合 半乳糖苷酶融合 trpE融合蛋白 谷胱甘肽S转移酶（GST）融合 硫氧还蛋白（Trx）融合 麦芽糖结合蛋白（MBP）融合 碱性磷酸酶（phoA）启动子和信号序列 Protein A Protein A GSTGST（glutathione S-transferaseglutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, CBD (chitin-binding domain, BioLabs;BioLabs; cellulose-binding domain, cellulose-binding domain, NovagenNovagen) ) calmodulin-binding domain, calmodulin-binding domain, StratageneStratagene) ) MBP (maltose-binding protein)MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein)GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin *Thioredoxin *帮助二硫键形成帮助二硫键形成帮助二硫键形成帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC。