分子遗传学笔记.doc

12分子遗传学绪论核酸的发现:作为遗传物质所应具备的条件：1多样性：贮存并表达多种遗传信息 2连续性：准确传递后代 3稳定性：物理、化学性质稳定 4多变性：有遗传变化的能力一、DNA作为遗传物质的证据 肺炎球菌的转化试验 病毒侵染大肠杆菌试验 真核细胞的基因转化转化：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象二、DNA的一级结构核酸的化学组成：核酸是以核苷酸为基本结构单位，通过3’, 5’-磷酸二酯键形成的链状多聚体 核苷酸(Nucleotide)：核苷(Nucleoside)，含氮碱基，戊糖；磷酸基团三、DNA的二级结构1、DNA双螺旋模型的诞生：Watson & Crick建立双螺旋模型，其特征是：主链：右手双螺旋，脱氧核糖和P为骨架，位于外侧，两条主链反向平行螺旋, 直径￠2nm碱基配对：位于内侧，嘌呤和嘧啶（A-T,G-C）螺旋参数：任一条链绕轴一周的升降的距离3.4nm，10对苷酸，相邻碱基0.34nm大沟和小沟：骨架双链在螺旋轴上的间距不等，在DNA表面形成宽窄不等的大小沟大沟宽2.2nm，是蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息位点。

小沟宽1.2nm3、旋稳定的因素决定双螺：1、氢键：结构的稳定性与G+C的含量成正比，G-C>A-T.2、碱基堆积力：嘌呤和嘧啶具疏水性,产生疏水区而与介质分开,使碱基与水的接触为最小3、其他：带负电荷的磷酸基与介质中的阳离子形成离子键,可有效地屏蔽磷酸基间的静电斥力四、DNA物理结构的不均一性1. 反向重复序列(Inveerted repeats)又称为回文序列（palindrome）,能形成发夹结构或十字形结构2. 富含A+T的序列 3. 嘌呤和嘧啶的排列顺序 碱基组成相同，但排列不同，双螺旋的稳定性有差别5’GC>5’CG ， 和碱基堆积力有关，碱基堆聚力是嘌呤向嘧啶方向大于嘧啶向嘌呤方向五、DNA二级结构的多形性DNA可以以多种形式的双螺旋结构存在1、A-DNA 2、B-DNA 3、Z-DNA 4、其他形式DNA: 三链DNA，四链DNA: 六、DNA的变性与复性1、基本概念：下列因素可导致DNA变性：高温 、 酸 、碱 、尿素 、甲酰胺2、DNA的熔解曲线: 双链DNA 的A260=1.00 （ 浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；单链DNA的A260=1.37； 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。

解链温度（melting temperature, Tm）或熔点，Tm是双螺旋失去一半时的温度，即A260的升高达到极大值一半时的温度是变性温度范围的中点Tm 时DNA，A260=1.185Tm值的影响因素：(1) DNA的均一性: 均一性高，Tm值的范围小(2) G-C含量: G-C含量高，Tm值高(3) 介质中的离子强度影响变性的因素：(1) 外部条件 (2) 内部条件：GC含量马默-多蒂（Marmur-Doty）关系式：Tm = 69.3+0.41(G +C)%，或GC%=（Tm-69.3）×2.44DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为增色效应（hyperchromicity）3、性反应曲线复－ Cot曲线:DNA复性时单链消失的速度:C/Co=1/1+KCotC：单链DNA浓度 Co：DNA总浓度 t：时间/秒，k：=二级反应常数复性分数C/Co决定于单链起始浓度和保温时间的乘积（Cot）定义C/Co=1/2时，Cot值定义为Cot1/2；即复性一半时DNA总浓度和时间乘积1/2=1/1+KCot1/2 1+KCot 1/2=2 k Cot1/2=1总DNA浓度相同时，不同DNA的Cot1/2 值不同复性动力学公式，复性进行一半时C/C0＝ 1/2＝1/1+KCot1/2根据复性动力学公式我们可以知到些什么？(1) 单链浓度随着时间的增大而减小；片断越短， Cot1/2 值越小，(2) 反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3) 以反应浓度和COt1/2的对数为座标可绘复性曲线(4) 通过Cot1/2值可测原核生物基因组的大小； (5)不同生物基因组大小不同，复性曲线也不同；可用以区分真核生物和原核生物基因组。

DNA复杂性越高，复性越慢， 基因组大复性慢.基因组的复杂性与其Cot1/2成正比单一序列和重复序列复性动力学曲线的区别_ 真核生物的DNA有重复顺序，而原核生物多为单一顺序1) 单一顺序的复性曲线常只有一个拐点，而重复顺序常有多个拐点2) COt 比值变化范围原核生物的COt比值为100,真核生物的COt比值大于100影响复性反应的因素(1) DNA片段的大小：片断小复性快，移动碰撞机会多(2) DNA的浓度：高浓度复性快(3) DNA复杂性： 简单序列复性快(4) 温度：过低温度减少互补链的碰撞机会最佳复性温度一般比Tm低25°C5) 盐的浓度：过低盐浓度使复性后的DNA又变性复性时要求盐的浓度达到足够高;在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些方法来检测？(1) 减色效应（hpochromic effect）测定光密度，即OD值（opticaldensity），DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2) 羟基磷灰石柱层析，羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易吸附单链而使其通过七、分子杂交1．特点是：(1)都是应用复性动力学原理；(2)都必须有探针（probe）的存在。

2．探针就是用同位素或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异DNA或RNA序列3．杂交：不同来源的单链核酸经碱基互补配对而形成的双螺旋，DNA-DNA, DNA-RNADNA杂交可反映不同生物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的进化，核酸杂交是现代分子生物学的基础4．常用的分子杂交方法_ 原位分子杂交（in situ hybridization）_ 斑点杂交（dot blotting）_ 萨瑟杂交（ Southern blot）_ 诺瑟杂交（Northern hybridization）_ Western blotting八、DNA超螺旋结构和拓扑异构现象1．生物体中大多数DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA则为松弛型DNA原核生物DNA，共价封闭环，再经螺旋就成为超螺旋真核生物DNA为线性，DNA与蛋白质结合之间的DNA可形成一个小“环”，类似共价封闭环，从而螺旋成为超螺旋2．正超螺旋：和DNA内部双螺旋缠绕方向相同的方向缠绕形成的超螺旋，结构更加紧密DNA每圈初级螺旋的碱基对小于10.5，则为正超螺旋3．负超螺旋：DNA绕其轴与右手双螺旋方向相反的方向缠绕所产生的超螺旋，结果减少每个碱基对的旋转，每圈初级螺旋的碱基对大于10.5，则为负超螺旋。

超螺旋是耗能过程，超螺旋的产生可能为能量的储存形式4．拓扑异构现象拓扑异构酶Ⅰ 催化DNA链断裂和重新连接每次只作用于一条单链，无需ATP，功能是松弛DNA， 代表：E.coli拓扑异构酶Ⅰ，对单链DNA的亲和力比双链高，能识别负超螺旋区，使负超螺旋扩大化而成松弛状，该酶不能松弛正超螺旋；真核生物拓扑异构酶Ⅰ可结合15-19核苷酸的双链区域,其断裂点在此区域中间.该酶倾向于结合超螺旋而不是结合松弛DNA区域,对正负超螺旋都有松弛功能.拓扑异构酶Ⅱ 大肠杆菌拓扑异构酶Ⅱ又称DNA旋转酶(DNAgyrase)，能催化断裂和连接双链DNA，需能量ATP参与，无碱基序列特异性，DNA旋转酶结合到双链闭环分子中在ATP的作用下产生负超螺旋无ATP时只能缓慢松弛负超螺旋而不能松弛正超螺旋大肠杆菌拓扑异构酶Ⅱ主要功能是引入负超螺旋以抵消复制叉移动所产生的正超螺旋，还具有形成或拆开双链DNA环连体的能力该酶对DNA的结合顺序是正超螺旋>松弛>负超螺旋5．拓扑异构酶的生物学功能：_ 恢复细胞过程产生的DNA超螺旋，如复制叉前的正超螺旋、转录时聚合酶前产生的正超螺旋 防止细胞DNA过度超螺旋，维持超螺旋的稳定水平。

生物体内5％负超螺旋，有利于基因的转录、基因组稳定、促进重组 去连环活性（大肠杆菌）、染色体凝缩（真核）、解开缠绕DNA双螺旋6．拓扑异构酶的催化反应本质：是先切割DNA的磷酸二脂键，改变DNA链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能，但是它不能连接事先已经存在的断裂DNA，是DNA复制、重组和转录中必需的酶九、常见DNA分子形式及相互关系Ⅰ型DNA：具正、负超螺旋的双链环状DNA S＝1.41；Ⅰ’型DNA：无超螺旋的双链环状DNA，是松弛型S=1.14；Ⅱ型DNA：一条链或两条链上有一个或几个切口的双链环状DNA S=1.14；Ⅲ型DNA：线形双链DNA S=1.00；崩溃DNA：Ⅰ型或Ⅰ’型DNA变性时，氢键断裂但两条链无法分离而紧密缠绕的分子S=3.0单链环状DNA： S=1.14线状单链DNA： S=1.30连环状DNA： 两个Ⅰ型DNA环连而成S<1.41沉降系数：CsCl密度梯度离心时的表示单位CsCl本身有梯度，在离心时将不同分子大小的物质集中到它自身的不同梯度中在同一种密度梯度离心条件下，沉降系数大表示易沉淀，则具有较高的超螺旋鉴定DNA超螺旋的手段第二章染色体、基因组和基因一、原核生物和真核生物真核生物：有完整的细胞结构；遗传物质集中在有核膜包围着的细胞核中与特殊的蛋白质相结合形成染色体结构原核生物：没有真正的核结构；遗传物质存在于整个细胞之中，以裸露的核酸分子存在，不形成染色体结构，也常被称为染色体噬菌体和病毒：是一种超分子的亚细胞生命形式，繁殖必须在寄主体内进行，遗传机制与其寄主密切相关二、基因组大小与C值矛盾 基因组（genome): 一个物种的单倍体的染色体的数目C值（C value） ：即单倍体基因组的DNA总量。

它是每一种活生物的一个性质C值矛盾（C值佯谬，C value paradox）：人们无法用已知功能来解释基因组的DNA含量，所以产生了C值矛盾：与预期的编码蛋白质基因数量相比，基因组DNA含量过多；一些物种间的复杂性变化范围并不大，但C值却很大三、原核生物染色体及其基因一个染色体即一个核酸分子（DNA或RNA）大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在；大多数为环状，少数为线状E.Coli 基因结构特点： 功能上相关的几个结构基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点即启动子和操作子在基因转录时协同动作（操作元形式）蛋白质基因通常以单拷贝的形式存在RNA基因通常是多拷贝的不同基因的启动子和操作子DNA序列不同，实现表达的精细调节结构基因：编码蛋白质的特定DNA序列，常为单拷贝调节基因： 一类对其它基因的活性进行调节或限制的基因 操纵子(元）：功能上相关的几个结构基因相连，由一个共同的调节基因和一组共同的控制位点即启动子（promoter）和操纵基因（operator，也称操作子）在基因表达时协调作用这种基因表达调控结构组成一个单元，称为操纵子（也称为操纵元，Operon）调控子：一个调节基因的产物能同时调控几个非相邻的结构基因的表达。

操纵子的不同结构基因是相邻的而调控子的结构基因位于同一染色体的不同部位或不同染色体可读框: DNA中具有潜在编码蛋白质氨基酸的核苷酸序列编码区：DNA中对应于蛋白质中氨基酸序列的核苷酸序列转录单位：包括转录的启动子及其上游的其它调控区域、基因本身和转录的终止序列间隔区：位于结构基因间不被转录的。