血清清蛋白、γ_球蛋白的分离、提纯与鉴定.doc
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血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1. 掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；3. 了解柱层析技术二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,各行使其重要的功能 本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离,并用电泳技术观察蛋白质分离教果1．盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白质分子沉淀析出的方法很多,根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵<
2． 脱盐 盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐,需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐,常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐本实验采用凝胶层析法脱盐,在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱；反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质3. 纯化〔离子交换层析离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂 本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合,带正电荷的点正电荷的离子则不能,这样便可达到分离纯化的目的脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们的等电点的不同可进行分离血清中各种蛋白质的pI各不相同,因此,在同一醋酸铵缓冲液中,各蛋白质所带的电荷不同,可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来4. 纯度鉴定〔电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同因此可以将它们分离为清蛋白〔Albumin>、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带三、材料与方法：以流程图示意1.实验材料人血清、葡聚糖凝胶G-25
② 脱盐：过凝胶层析柱步骤步骤操作〔1调节层析柱液面葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗平衡后,取下恒压储液瓶管塞,小心控制柱下端螺旋夹,使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面〔2加样品用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液,小心而缓慢的加入凝胶床上面,柱下端用10ml刻度离心管接液,拧松柱下螺旋夹,调节适当流速,使样品进入凝胶床,至液面降到凝胶床表面为止〔3洗层析柱小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁,以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液〔4洗脱待样品液进入凝胶床内,继续用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗,同时注意流出液量〔5检测及收集蛋白质 在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸,随时检查流出液是否含有蛋白质,①滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液,若出先白色混浊或沉淀,表示已有蛋白质流出〔当凝胶床体积为5.5ml时,流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出,立即收集流出的蛋白质溶液②收集约12滴后,滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L<1%>BaCl2的黑色反应板凹孔内,一旦见出现白色沉淀〔表示有SO42-,立即停止收集收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱,进行离子交换层析<6>层析柱再生平衡收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液流洗,用BaCl2液检测层析柱流出液,当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后,继续洗涤2~3ml。
凝胶层析柱即可再生平衡,可再次使用注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时,不要使液面低于纤维素膜表面,以免空气进入凝胶床b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事,要小心缓慢加入,不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆,因为二者相应生成物的沉淀均为白色d.洗脱是应注意及时收集样品,切勿使蛋白质峰溶液流失e.葡萄糖凝胶价钱昂贵,要回收再生避免损耗,严禁倒掉③ 球蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱步骤 操作〔1调节层析柱换冲液面经处理再生好的DEAE纤维素层析柱,取下其恒压储液瓶管塞小心控制柱下端螺旋夹,使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面柱下端用10ml刻度离心管收集液体,以便了解加样后液体的流出量〔2加样品将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上,调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床,至液面降到纤维素柱床表面为止〔3析层析小心用1ml 0.02mol/L PH 6.5的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液〔4洗脱待样品进入纤维素柱床内,继续用0.02mol/L PH 6.5的醋酸铵缓冲液流洗,。
同时注意流出液量〔5检测及收集蛋白质流洗时,随时用0.92mol/L磺基水杨酸检查流出液中是否含蛋白质〔方法同前当有蛋白质出现时,立即连续收集三管,每管10滴,此不被DEAE纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白,取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用注意：a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时,不要使液面低于纤维素膜表面,以免空气进入凝胶床b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事,要小心缓慢加入,不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆,因为二者相应生成物的沉淀均为白色d.洗脱是应注意及时收集样品,切勿使蛋白质峰溶液流失,特别是收集伽马球蛋白时④ 清蛋白的纯化：过DEAE纤维素阴离子交换层析柱步骤 操作〔1调节层析柱缓冲液面此时DEAE纤维素层析柱不必再生,可直接用于纯化清蛋白小心控制住下端螺旋夹,使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面,柱下端用10ml刻度离心管收集液体,以便了解加样后液体流出量〔2加样品将除盐后收集的清蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上,调节层析柱下端的螺旋夹,使样品进入纤维素柱床,至液面降到纤维素柱床表面为止 〔3洗层析柱将除盐的粗制清蛋白溶液上柱后,改到0.06mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱小心用1ml 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液〔4洗脱待样品进入纤维素柱床内,继续用0.06mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗。
同时注意流出液量流出约6ml〔其中含α-球蛋白及β-球蛋白后,将柱上的缓冲液面降至与纤维素表面平齐改用0.3mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱〔5检测及收集蛋白质用0.92mol/L〔20%磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质〔方法同前由于纯化的清蛋白仍然结合有少量胆色素等物质,故肉眼可见一层浅黄色的成分被0.3mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱下来,大约改用0.3mol/L NH4AC缓冲液洗脱约2.5ml时,即可在流出液中试出有蛋白质出现,立即连续收集2管,每管10滴,此即为纯化的清蛋白液,留作纯度鉴定用〔6纤维素层析住的再生与平衡用过的DEAE纤维素层析柱,应重新再生平衡先用约6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC溶液流洗,再用0.02mol/L pH6.5 NH4AC液约10ml流洗平衡即可注意：a.当层析柱的缓冲页面或样品页面刚好下降到纤维素膜表层时,不要是液面低于纤维素膜表面,以免空气进入凝胶床b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事,要小心缓慢加入,不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整C.使用时切勿将各时段所用的溶液浓度搞混d.洗脱是应注意及时收集样品,切勿使蛋白质峰溶液流失。
⑤ 纯度鉴定〔醋酸纤维素薄膜电泳步骤 操作准备电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上,两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液,使其在同一水平a,页面与支架距离2~2.5cm,用三层滤纸或双层纱布搭桥薄膜准备：将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段,在薄膜一段1.5cm处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线,末端用铅笔做记号进入巴比妥溶液中直至浸润完全用镊子青青取出,粗面朝上,平放在两层干滤纸中间,轻轻拭去多余的缓冲液点样薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上,粗面朝上,用玻片或载玻片一段的截面在盛有样品的直接沾取2~3微升待测品,让后将样品与薄膜点样先轻轻接触,均匀分布在点样线上,带样品渗入薄膜后移开,四种样品分别点样电泳将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上,点样面朝下,点样端至阴极,轻轻拉平薄膜平衡约5min,使缓冲液渗透大道平衡接好电路,调节电压开始电泳待各个样品没有变化停止电泳,并轻轻取出染色漂洗和鉴定将染色液倒入大培养皿中,电泳完毕后用镊子取出薄膜,直接浸入染色约5min后将薄膜取出,漂洗至背景无色,观察电泳情况得出结论四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论,并得出结论。
1.实验结果从电泳图谱中可以看出,清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白质与血清的清蛋白电泳图谱几乎一致,可以确定管内的蛋白质为清蛋白,同理球蛋白管内的蛋白质为γ-球蛋白2. 实验讨论1) 血清电泳中个别电泳带的两条带之间界限不明显① 染色。
