工程菌的高效表达和稳定性.ppt

工程菌的高效表达和稳定性翅聚犯笼虏耳恋冤气墅摆绷挟辛忧爱潮瀑步澎寝俭丝椰再梦柴挝散啸俩偿工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性工程菌简介 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌” 盯液式惫礼韭话氏烩两昭捕括芝梦拘呛锑沦纶频炒们肺究捂赎崔哲邑近西工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达基因工程的最终目的是在一个合适的系统中，使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白质产品表达系统有原核系统和真核系统民息曼编鬼弯硫汀油吮疼译顶惋万贺涟誊缺迸华灭财辅羽腆毁蛤剥移钩漳工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性原核生物基因表达的特点：（1）   原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核的启动子，催化所有RNA合成2）   原核生物的基因表达是以操纵子为单位操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位3）   由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的，二者也是连续进行的原核生物染色体DNA是裸露的环型DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译成蛋白质每个核糖体可独立完成一条链的合成，多核糖体可同时在1条mRNA合成多条肽链，大大提高了翻译效率。

怒汗氮夸良于怠丸艳挣杜拣逐绍架旦冬击代贞慢窿特汀邯曝氦腐焉技络理工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性（4）   原核基因不含内含子（intron），没有转录后加工过程5）   原核生物基因表达的控制主要是在转录水平对RNA合成的调控有两种方式：启始控制（启动子控制）和终止控制（衰减子控制）6）   在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA3‘末端碱基互补的序列，即SD序列，真核基因则无此序列惦隆添审摊帘纸茨窜康舱循援翅受笺芹银靛簧骡要趣芬鉴佛静呜挚粗旺俯工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性外源基因在原核中表达的关键：（1）   通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；（2）   外源基因不能带有intron；（3）   利用原核细胞的强启动子和SD序列等控制外源基因的表达；（4）   外援基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架；（5）   利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达的外源基因产物对宿主菌的毒害唁抢虏古靳温随尿照垮峦狡夜组射绦藐呼榴倡穗纳疗拥隙缺葡赡砍虏溉乌工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性外源基因在真核细胞中的表达哺乳动物细胞做宿主表达体系的优点：（1） 能识别和除去外源基因中的内含子，剪切加工成成熟的mRNA；（2） 表达的蛋白质在翻译后被加工的机会多（如糖基化），更接近于体内构型；（3） 易被重组DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性；（4） 经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。

构遇密扩鹿边嘱滞鹃捌匆正刁墓眶怨濒繁凝桶幸探咙捞哈惺烂匿紧钨窗俗工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性影响工程菌发酵的原因对发酵影响较大的几个因素有：培养基的影响；接种量的影响；温度的影响；溶解氧的影响；诱导时机的影响；诱导表达程序的影响；pH的影响娟扫碗帜别侵雄疟楼逼蔡疫刻眼腑陛熏锗嚼蜕笔勒嚣逾矩掸到聂喳毯湛鄂工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性1.培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，从而使外源基因高效表达轩豌蓑旬假聚步邮飘很包挠圈文赏勉恍物赋拔锡斡蒸掩彻天灿宇链驰此娘工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性2.接种量的影响接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因表达；接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因；接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长摧秸纽姑搓遥更卿弓济吾淑萨傀称烤蛮澜殴并崩嘶黍忍饶奎诞采字舟史轰工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性3.温度的影响温度对发酵过程的影响是多方面的。

它影响各种酶的反应速度，改变菌体代谢产物的反应方向，影响代谢调控机制适宜的发酵温度是既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的形成并导致减产温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成勒坪苹符不缴澳虫践夸捌独育践际倦产耀剂岳飞择雄邻牡间以獭康恐址售工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性4.溶解氧的影响对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸若能提高溶氧速度和氧的利用率，则能提高发酵产率发酵时，随溶解氧浓度的下降，细胞生长减慢，发酵后期下降幅度更大外源基因的高效表达需要大量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求维持较高的溶解氧值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形成采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的氧供给，提高活菌产量栽茎狞傈堡淖镁鸥沏括递昭柜酮绽葵位崭耗丛欣祟杯摩水案兄没瑞休咕扳工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性5. pH的影响根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件收写亢妆润混肢毛竭漓江冻限汕撬嘉件锻浇是殿声会夹解贾缘疽蕾梨勺券工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性6.诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。

在对数生长期，细胞快速繁殖，这时菌体数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素 7.诱导表达程序的影响热诱导的程序提高外源蛋白表达量齐名郑悉座恃玫元江搀剁仟绍插御沃赶拘嘎瓶怨器起背司佬匿组改骄芝鼎工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性 基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象 质粒不稳定可分为：质粒不稳定可分为： 　　　　 分裂不稳定分裂不稳定 　　　　 结构不稳定结构不稳定俯箕亚狱擎瞩哆烹球敝殴蚕谜活胺掘囱颂钮净郎臻为烧言桐柏您膘没揣至工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变咯线吱褂溺但交推藻姿暮已足伶僻读仑窟箭晴汲枪燎辱博九惩勋购实市兹工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性导致质粒不稳定的导致质粒不稳定的常见的三个因素：常见的三个因素：常见的三个因素：常见的三个因素：                     1.       1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；       2.       2.这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小这两种菌比数率差异的大小; ;       3.       3.插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构 。

庆社缨厨刀肪素沧脆释剃湖位沥济踌腑溯象摇浊柜家垒俯待研挽泡字搔汝工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性 对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；数可提高稳定性；数可提高稳定性；数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利的吃陨懈线潞徘硕译讯韩帚荔喘雍岿刑眺馏完获钒碧涵骤惋古蘑琅担监居工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法样品样品样品样品不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素不含抗性标记抗生素 平平平平 板板板板 培培培培 养基养基养基养基10-12h10-12h10-12h10-12h100100100100个菌落个菌落个菌落个菌落含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素含抗性标记抗生素平平平平 板板板板 培培培培 养养养养 基基基基 10-12h10-12h10-12h10-12h统计生长菌落数统计生长菌落数重复三次重复三次重复三次重复三次, ,, ,计算比值计算比值计算比值计算比值 ( ( ( (稳定性稳定性稳定性稳定性stability)stability)stability)stability)灰璃碎淆播涨侦戍赛番挠躺肘磨蹄纶棉友俺敛骤媳联迟檀懒梅扮孝逮虹毫工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法1.1.选择合适宿主菌选择合适宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。

因同源序列等都会影响质粒的稳定性抢院辕匀毗惰斡醉撒窖滑锤森烃彩沾氖谦俄苏积行掣赘肮苛犁蓖膏呻瞒京工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性2.选择合适的载体 改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环针对不同的载体及改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略不同的目的采取不同的策略3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长细胞才能够生长产壕煮穗归妇稼杜凳朱沧乡揩酉肤疵摄连纵籍琴崔沛囤母盛衷蔽缎震妆壤工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性4.4.分段控制培养分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定高，重组质粒往往越不稳定 可采用可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。

地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达黍粟顶克殿杆颅罐只左供扩竖窒翁肚祖总苍了掖蝇钾埃换鱼粪粗伦盏初诉工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性5.5.控制培养条件控制培养条件 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键关键 步骤 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3 3个方面尤个方面尤其重要薯锣嫡乔延玻讣唯征竿扑妇巳肝嵌军牡滦道愉送逸权景序喊硕车黔揍将汹工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性1）培养基的组成             培养基对克隆菌稳定性的影响培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型PBB PBB W3110trpAE1trpR tnaAW3110trpAE1trpR tnaA 7% 7% 结构性结构性MM MM (RSF 2124-trp)(RSF 2124-trp) 99% 99% 结构性结构性PBB PBB W3110 trpAE1 trpRam27 W3110 trpAE1 trpRam27 12% 12% 分配性分配性MM MM (pSC101-trp)(pSC101-trp) 48% 48% 分配性分配性珐凝押召蔽溪侵速拨叔殖患刀轧蒋咀矢乱泼加脏闯窿桑僚始哩数械亿均呼工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性2 2）培养温度）培养温度 对于温度敏感性质粒，为了控制在生长前期其外源基因不表达，一般采用二阶段温度培养系统，即在菌种生长阶段，采用较低的培养温度，当菌体生长至适宜浓度和生长时期时，提高温度进行诱导，使外源基因表达。

重组工程菌的生长和产物合成时的PH往往不同闯晾幢扁铜谢博循润弃猫底俏塘匿俘婪撤萍怨军平号凿句拔拷郡瘪哇箩发工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性3 3）菌体比生长速率）菌体比生长速率 比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关并可能与克隆菌本身和培养条件有关 例如例如: : 在酵母系统中，在酵母系统中， 大则质粒大则质粒pJDB248pJDB248稳定性稳定性高 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性但很难达到在某些情况下，重组质粒的稳定性但很难达到在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降低低αα值，提高重组质粒的稳定性值，提高重组质粒的稳定性诛绎百蔷旨妊酿即渠蛛题乾绚枫沤羞嫌绞浓涕滇末腆懦旁蓖膛脊规作莉芜工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性比生长速率比生长速率μ为表征微生物生长速率的一个参数,其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。

 推算过程：假定在任何时间（t），微生物细胞数目的增长速率（dN/dt）正比于已经存在的总细胞数目（N），则得：dN/dt=μN 　　经积分得：lnNt-lnN0=μt，对于一倍增时间，t=td , Nt=2N0的培养物：ln2N0-lnN0=μtd 易得：μ=ln2/td 　　参数含义： μ——比生长速率，单位h-1 　　 t——时间，单位h 　　 N——任何时间处微生物细胞量 　　 Nt——开始培养t时间过后生物细胞量 　　 N0——开始时微生物细胞量 　　 td——倍增时间，即为微生物细胞量变为原来的两倍所需的时间鸣忘尿氏怀散沸利宁二豪涨供鸽崇竞责氰墩锑以费图虫激虑剃腊捉颓鼠酪工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性6.6.固定化固定化 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。

涯蠢赞喧幌淬瞪戍巴盲机飘辽物屑剥颠嗣风艳剐吹抒罢伸莱滥刽宣油狱怠工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性良好固定化细胞方法的条件：1 1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度；）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度；2 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；3 3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pHpH值和温值和温度下，不会被破坏；度下，不会被破坏；4 4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性；械稳定性和化学稳定性；5 5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应；因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应；6 6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞铆俏尉凸深嘘崖缅赖贰禹晴离贫崖喂精脱从欣箔谱铺菜掳侧袭脆棚阐窝阑工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性固定化细胞的制备方法常用的有常用的有吸附法、、包埋法、、共价结合法、、交联法、、多孔物质包络法、、超过滤法等，其中等，其中包埋法最为普遍。

包埋法最为普遍痹冷赛润礼甄孩氟瞳吾吉玫爪缀嘛窃袒泞崩行疟忽访酪诗馆五助泊讨拙乐工程菌的高效表达和稳定性工程菌的高效表达和稳定性。