第14章核酸的物理化学性质.ppt

第第1414章章 核酸物理化学性质核酸物理化学性质一、核酸的水解一、核酸的水解 酸、碱、酶水解酸、碱、酶水解•作用于磷酸二酯键和糖苷键作用于磷酸二酯键和糖苷键•DNA/RNA对酸对酸/ /碱的碱的耐受程度耐受程度有差别有差别二、核酸的酸碱性二、核酸的酸碱性质质具有芳香环结构特点具有芳香环结构特点•能发生酮式能发生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亚氨式互变亚氨式互变•嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 ____________主要是环内氨基的贡献主要是环内氨基的贡献1 1、碱基的解离、碱基的解离 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到则结合到N7上上2、核苷的解离、核苷的解离•戊糖可增强碱基的酸性解离戊糖可增强碱基的酸性解离•核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离3.3.核苷酸的解离核苷酸的解离•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性磷酸基使核苷酸具有很强的酸性•DNADNA等电点为等电点为4 4～～4.54.5；；•RNARNA等电点为等电点为2 2～～2.52.5三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收• 碱基含有共轭双键碱基含有共轭双键•最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右核酸溶液紫外吸收以核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度摩尔磷的吸光度表示，摩尔表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。

磷即相当于摩尔核苷酸 ε：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径：比色杯内径•OD260的应用：的应用：1. DNA或或RNA的定量的定量–OD260=1.0相当于相当于•50μg/ml双链双链DNA•40μg/ml单链单链DNA（或（或RNA））•20μg/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度–DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8–RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0–含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低3.判断判断DNA是否变性是否变性四、核酸的变性、复性与杂交四、核酸的变性、复性与杂交( (一一) ) 核酸的核酸的变性变性（（denaturation）） 1 1、、DNA的变性的变性：： 在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解开成两条单链的过程开成两条单链的过程 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。

生物活性发生改变 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2 2、变性的实质、变性的实质降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3’，，5 ’-磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂 高温高温（一般＞（一般＞75℃75℃））— 热变性热变性 强酸、碱强酸、碱 — 酸碱变性酸碱变性 甲醛甲醛（（Agarose中中RNA ）） 尿素尿素（（PAGE中中DNA ））3 3、变性因素、变性因素 ODOD260260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失4、变性后理化性质变化、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有的变性引起的性质变化没有DNA明显明显完全变性后核酸紫外吸收值增加：完全变性后核酸紫外吸收值增加：•天然天然DNA 25－－40%、、RNA 约约1.1%•实质：碱基暴露实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称象称增色效应增色效应DNA变性变性5、、DNA热热变性的特征变性的特征变性过程是变性过程是““跃变式跃变式””的，而非渐的，而非渐变变Ø解解链链曲曲线线：：连连续续加加热热DNADNA，，以以温温度度对对A A260260作图，所得的曲线称为解链曲线作图，所得的曲线称为解链曲线。

•指增色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度•一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90  C之间之间Ø Tm：：DNA变变性性时时，，OD260达达到到最最大大值值的的50%时时的的温温度度称称为为DNA的的解解链链温温度度或或融融解解温度温度(Tm)Ø大小与大小与G+C含量成正比含量成正比（（1 1））DNA的均一性：的均一性：（（2））G－－C含量：含量： 经验公式：经验公式： XG+C＝（＝（Tm－－69.3））×2.44（（3））介质中的离子强度：介质中的离子强度： Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：( (二二) )核酸核酸的的复复性性（（renaturation））•变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链单链重新缔合成双链——复性复性热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing) DNA复性复性•分子量越大复性越难；分子量越大复性越难；•浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易；•DNA复性也与它本身组成和结构有关复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列（具有很多重复序列DNA，，复性快）。

复性快）•减色效应减色效应（低色效应）（低色效应）——复性时紫外吸收减少的现象复性时紫外吸收减少的现象( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子分子杂交分子杂交, ,标记的探针标记的探针DNADNA变性后与变性后的变性后与变性后的靶靶DNA/RNADNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程种分子的过程 分子杂交包括分子杂交包括：：DNA-DNADNA-DNA杂交，杂交，DNA-RNADNA-RNA杂杂交及蛋白杂交等交及蛋白杂交等 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶定复杂的靶DNADNA中同源的中同源的DNADNA片段双链双链probeprobe或或DNADNA解链，主要取决于：解链，主要取决于： 1 1．．链的长度链的长度：链越长，需要的：链越长，需要的 能量多才能量多才能解链；能解链； 2 2．．碱基成分碱基成分：：GCGC含量高，较难变性；含量高，较难变性； 3 3．．化学环境化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链胺，尿素破坏双链一、杂交探针的获得一、杂交探针的获得•是指一段目的基因或是指一段目的基因或DNA/RNADNA/RNA片段特异杂交片段特异杂交的核苷酸序列。

的核苷酸序列•ProbeProbe可以是整个基因，或是基因的一部分，可以是整个基因，或是基因的一部分，是是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA DNADNA杂交常用的方法杂交常用的方法（一）（一）.Southern blot.Southern blot 19751975年，英国科学家年，英国科学家SouthernSouthern首创，是指首创，是指DNA-DNADNA-DNA杂交，是经典的基因分析方杂交，是经典的基因分析方法 1 1、原理和步骤、原理和步骤: : 提取提取T T 、、Cell DNACell DNA 限制酶消化限制酶消化 DNADNA片段片段 电泳分离电泳分离 变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜 变性、杂交变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析•应应 用用: :(1)(1)基因组结构分析基因组结构分析：： 如缺失如缺失、、插入插入、、倒位等的检测倒位等的检测 (2)RFLP(2)RFLP连锁分析连锁分析（二）、（二）、Northern blotNorthern blot•是指是指DNA-RNADNA-RNA分子杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录分子杂交，应用特异性基因探针分析基因的转录水平水平1 1、、原理及步骤原理及步骤：：提取提取 T T、、Cell Cell 总总 RNARNA ↓ 提纯分离提纯分离mRNAmRNA ↓ 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离RNARNA ↓ 转移至硝酸纤维素膜转移至硝酸纤维素膜 ↓ 杂交检测杂交检测•应应 用（用（1 1））. .检测检测mRNAmRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；；•（（2 2））.mRNA.mRNA的含量，即基因表达高低。

密度扫描仪，定量的含量，即基因表达高低密度扫描仪，定量分析）分析） 三、三、Western blotWestern blot是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 原理及步骤原理及步骤：： T or cellT or cell ↓ 提取蛋白提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白 （（SDS-PAGE ））↓ 转移（印迹）于硝酸纤维素膜转移（印迹）于硝酸纤维素膜 ↓• 加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质。