含糖腹膜透析液对体外培养腹膜间皮细胞表型的影响.pdf

硕士学位论文含糖腹膜透析液对体外培养的腹膜间皮细胞表型的影响研究生：陈生晓指导老师：刘郑荣副教授任吴副教授摘要研究背景目前研究表明，腹透时反复发生腹膜炎及透析液( P D S ) 的生理不相容性是导致腹膜纤维化的主要因素一般来说，腹膜具有较强的自我修复能力，多数情况下可消除炎性渗出物，完全恢复正常状态而不至于结构形态发生改变但长期腹膜透析并发腹膜炎却易发生弥漫性腹膜纤维化，这其中除了炎症反应导致的组织损伤改变外，P D S 的生理性不相容性起了很大作用近年来腹膜透析的方法及材料不断改进提高，腹膜炎的发生率已经大大下降，导致腹透失败的重要原因不是腹膜炎而是P D S 的生理不相容性P D S 的生理不相容性主要来自其低P H 值、高渗、高糖及乳酸盐缓冲液等，其中高浓度葡萄糖是C A P D 相关性腹膜纤维化的最重要因素，腹膜透析液内葡萄糖浓度是体内正常浓度的1 4 - 4 0 倍，覆盖腹膜的主要细胞腹膜间皮细胞就直接浸润在这种高糖环境中病理组织学显示C A P D 相关性腹膜硬化最重要的特征之一就是腹膜表面间皮细胞层丧失腹膜间皮细胞起源于中胚层，可以同时表达上皮细胞和纤维细胞特征性的中间纤维角质蛋白和波形纤维蛋白，可合成多种细胞外基质蛋白、金属蛋白酶等基质降解酶，在组织损伤与修复过程中起重要作用。

长期用高糖腹透液进行腹膜透析可使得腹膜间皮层细胞脱落、缺失，金属蛋白酶等基质降解酶产生减少，基质金属蛋白酶及其抑制剂( 删P ／T I M P ) 平衡被破坏，抑制细胞外基质( E C M )的降解；同时增加纤维连接蛋白( F N ) 、活化蛋白1 ( A P —1 ) 表达来促进E C M 的分中文摘要泌，沉积在问皮细胞脱落处，促进腹膜纤维化腹膜问皮细胞数目的减少还减少I L 一1 、I L 一6 等多种中性粒和单核细胞特异性化学趋化因子的分泌，对抗微生物入侵的能力减弱，腹膜腔感染、炎性物质渗出，加据腹膜纤维化，最终导致腹膜硬化和腹膜功能丧失本研究旨在观察高糖P D S 对大鼠腹膜间皮细胞细胞增殖活性、凋亡率、细胞内游离钙水平、水通道蛋白一1 和细胞间黏附分子．1 表达的影响，从而进一步揭示高糖P D S 损伤腹膜间皮细胞的机制研究方法我们选择体外培养s D 大鼠的腹膜间皮细胞( R P M C ) ，采用如下方法观察高糖P D S 对腹膜间皮细胞表型的影响：1 、R P M C 的分离、培养与鉴定细胞培养过程设计根据S a t o h 和P r e s c o t t报道的方法略加修改。

大鼠腹腔内注入0 ．1 2 5 ％t r i p s i n 一0 ．0 1 ％E D T A 2 N a消化2 0 分钟，抽取腹腔内液体离心，沉淀细胞用含1 0 ％胎牛血清( F C S )的1 6 4 0 完全培养液重悬后接种于培养瓶，3 7 C 、5 ％C O ：培养箱孵育第3 —5 代用于实验细胞鉴定根据显微镜下形态学，间接免疫荧光法抗角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体和抗V I I I 因子抗体检测2 、含糖P D S 对R P M c 增殖活性的影响根据M o s m a n n 经典M T T 法改良根据不同刺激条件分4 组：含1 ％F C S 的1 6 4 0 完全培养液( 阴性对照) ，含1 ．5 ％糖P D S ，含4 ．2 5 ％糖P D S ，含4 ．2 5 ％甘露醇P D S ( 阳性对照) 换成刺激液体l 、2 、3 小时后加M T T ，继续培养4 小时，显微镜下观察到细胞内形成颗粒状蓝紫色结晶，加入D M S 0 液振荡溶解，在发射波长为5 7 0 n m 的酶标仪上测定各孔吸光度值( A 值) ，计算细胞增殖抑制率= 【卜( 处理组A 值一空白对照组A 值) ／( 阴性对照组A 值一空白对照组A 值) 】X 1 0 0 ％。

3 、含糖P D S 对R P M C 细胞周期的影响分组同上换成刺激液体4 小时后I I硕士学位论文消化收集细胞，用冰7 0 ％乙醇4 ℃过夜，加入含0 ．1 ％N P 一4 0 和0 ．1 ％柠檬酸钠的R N a s eA ，3 7 C 放置3 0 分钟后P I 染色，过筛网成单细胞悬液，流式细胞仪检测，记录发射波长6 3 0 h m 处红色荧光A n n e x i nv ／P I 双标记检测凋亡细胞细胞分组同上，分别刺激1 、2 、3 小时后消化收集细胞到E P 管，1 0 0 0 r p m X5 m i n 离心后加入0 ．5 m l P B S重悬，加入l O u lM e d i aB i n d i n gR e a g e n t ，加入1 ．2 5 u lA n n e x i nV - F I T C ，避光室温条件下放置1 5 m i n ，室温下离心1 0 0 0 r p m X5 m i n 弃上清，轻轻的用0 ．5 m l 冰的1 ×B i n d i n gB u f f e r 重悬细胞，加入l O u lP r o p i d i u mI o d i d e ( 碘化吡啶) 。

避光冰上放置，迅速用流式细胞仪检测含糖腹透液对腹膜间皮细胞表面A Q P l 表达的影响细胞分组同上刺激3 小时后，消化分离细胞用含1 0 ％F C S l 6 4 0 培养液调整细胞浓度为1X1 0 7 ／m l ，取4 0 ul 细胞悬液加入预先有特异性小鼠抗大鼠A Q P l抗体的E P 管，再加5 0 u l1 ：2 0 ( 用D P B S 稀释) 灭活正常兔血清4 ℃封闭3 0 m i n ，用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 m l 左右，离心1 0 0 0 r p m X 5 m i n ，弃上清，加入5 0 u 1 工作浓度( 1 ：2 0 0 ) 的羊抗鼠F I T C荧光标记I g G ，充分振摇后置于4 C3 0 m i n ，用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 m l 左右，离心1 0 0 0 r p m X 5 m i n 去上清，加l m l 固定液后F C M 检测含糖腹透液对腹膜问皮细胞表面I C A M 一1 表达的影响细胞分组同上刺激3 小时后，消化分离细胞用含1 0 ％F C S l 6 4 0 培养液调整细胞浓度为1X 1 0 7 ／m 1 ，取4 0 ul 细胞悬液加入预先有特异性小鼠抗大鼠I C A M - 1 抗体的E P 管，再加5 0 u11 ：2 0 ( 用D P B S 稀释) 灭活正常兔血清4 ℃封闭3 0 m i n ，用洗涤液洗涤2 次，每次加洗涤液2 m l 左右，离心1 0 0 0 r p m X5 m i n ，弃上清，加入5 0 ul 工作浓度( 1 ：2 0 0 ) 的羊抗鼠F I T C中文摘要荧光标记I g G ，充分振摇后置于4 “ C3 0 m i n ，用洗涤液洗涤2 次，每次加液2 m l 左右，离心1 0 0 0 r p m X5 m i n 去上清，加l m l 固定液后F C M 检测。

7 、含糖腹透液对腹膜间皮细胞内游离钙的影响R P M C 接种于特制的培养皿上，8 0 ％的细胞融合后用H a n k ’S 液洗涤2 次，在3 7 ℃、避光条件下用F l u o 一3 ／A M ( 1 0um o l ／L ，预加1 6 ．5 m gF 1 2 7 ) 荷载，3 0m i n 后用H a n k’S 液洗涤2 次，用含1 ％F C S 的1 6 4 0 培养液孵育4 0 分钟后用激光共聚焦检测镜下找到荷载好的细胞后，扫描加刺激前细胞内[ C a 2 + ] i 荧光强度，然后吸出培养皿内的液体，换上刺激剂刺激3 分钟( 分别为无糖含钙腹透液、1 ．5 ％糖含钙腹透液、2 ．5 ％糖含钙腹透液、4 ．2 5 ％糖含钙腹透液、4 ．2 5 ％糖无钙腹透液、4 ．2 5 ％甘露醇含钙腹透液、4 ．2 5％甘露醇无钙腹透液、3 0 m 加( C L ) ( 注：上述含钙腹透液钙浓度为2 5 ．7 m g％) ，用共聚焦显微镜动态扫描加刺激后细胞内[ C a 2 + ] i 荧光强度的变化8 、水通道蛋白I ( A O P l ) 基因克隆及真核表达质粒的构建在I n t e r n e t 上的M e d l i n e 基因库中查到S D 大鼠的A Q P l 基因序列，由D N A S N S 分析软件对A Q P l 序列进行分析，设计引物序列为：上游引物57A T G G c c A G c G A A AT C 从G 从G 从3 ’( H i n dI I I ) ，下游引物5 ’T G A T C T A T T T G G G C T T C A T C T C C A3 ’( B a m HI ) ；依据T r i z o l 试剂盒说明，从S D 大鼠肾小管上皮细胞中提取总R N A ，并以它为模板，用设计的引物，于2 0u1 反应体系中进行R T —P C R ，扩增A Q P l 全长c D N A ；P C R 扩增、琼脂糖胶上进行电泳纯化、T A 克隆；分别对阳性克隆及p c D N A 3 ．1 载体酶切，A Q P l 基因与p c D N A 3 ．1 载体连接，转化，扩增，抽提质粒，分别酶切、P C R 步骤同前，测序鉴定。

9 、A Q P l 质粒转导、筛选、蛋白表达及其与细胞凋亡关系细胞密度达8 0V硕士学位论文％时开始转染，l u g 质粒+ l O O u l l ×T r a n s f e c t i n gB u f f e r + 2 u lG e n e C o m p a n i o n “I I 在1 ．5 m l 无菌E P 管中混匀，室温放置1 5 m i n ：吸取细胞上清，1 0 0 u 1 G e n e C o m p a n i o n ／D N A 复合物+ 9 0 0 u l 完全培养基滴加在细胞表面，置于3 7 “ C 、5 ％C 0 2 培养箱孵育；2 天后加入4 0 0 m g ／LG 4 1 8筛选2 周在对数生长期进行检测A Q P l 蛋白表达( A Q P l 表达步骤同上) 实验结果l 、R P M C 的分离、培养与鉴定第三代腹膜间皮细胞在相差显微镜下呈铺路石样外观，间接免疫荧光鉴定结果为抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体阳性，抗第V I I I 因子相关抗原阴性，排除了成纤维细胞、内皮细胞，鉴定为间皮细胞2 、含糖P D S 对R P M C 增殖活性的影响腹透液刺激一小时后，R P M C 细胞增殖被抑制，随着时间延长，抑制率也越高；对数据进行析因设计资料的方差分析，含4 ．2 5 ％糖P D S 组在l 、2 、3 小时的三个时间点细胞增殖抑制率远远高于含1 ．5 ％糖P D S 组( P 0 ．0 5 ) ，而4 ．2 5 ％糖腹透液组和4 ．2 5 ％甘露醇腹透液组A Q P l 表达显著性增加( P O ．0 5 ) ，而4 ．2 5 ％糖P D S 组( 图2 —3 ) 和4 ．2 5 ％甘露醇P D S 组A Q P l表达显著性增加( P 0 ．O l c m ) ，较低的活化能( E a l ，说明有水通道存在于质膜上。

这一过程很快，不需要“门控”等调节，基本上处于激活状态，且不受质膜分子组成、温度等的影响表达A Q P l 的卵母细胞在2 2 C 时，P f > 2 0 0X1 0 —4 c m ／s ，大约是对照组的8 倍：而在1 0℃时，表达A Q P l 的卵母细胞的P f 轻微下降，对照组P f 则明显下降，以至于只是表达A Q P l 细胞的1 ／3 0 ：对照组卵母细胞的E a > > 1 0 K C a l ／m o l ，而表达A Q P l 的卵母细胞的E a = 3 K C a l ／m o l ，与汞制剂共同保温时，P f 被明显抑制“⋯含有A Q P l 的质膜两侧有水运动时，即符合通道。