棉花木葡聚糖转移-水解酶基因克隆和分析.docx

    棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析    李先良　李居宁　李傲　夏涛摘要：为研究XTH基因与棉花（Gossypium spp.）纤维伸长的关系，克隆了两个XTH基因，分别命名为GhXTH1（GenBank：AY189971）和GhXTH2（GenBank：JN968478）GhXTH1编码区全长870 bp，编码289个氨基酸，GhXTH1全长885 bp，编码294个氨基酸序列分析表明，GhXTH1和GhXTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG生物信息学分析表明，GhXTH1和GhXTH2均含有信号肽跨膜结构预测表明，GhXTH1和GhXTH2均在N端存在跨膜螺旋系统发生学分析表明，GhXTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近，GhXTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近半定量分析表明，GhXTH1和GhXTH2均随着棉花纤维发育表达量降低，GhXTH2比GhXTH1表达量高关键词：棉花（Gossypium spp.）纤维；木葡聚糖转移/水解酶；克隆；表达分析；伸长：S562；Q78 ：A ：0439-8114（2017）04-0756-06棉花（Gossypium spp.）纤维是由胚珠表皮细胞发育而来，成熟纤维细胞长度可为其直径的1 000～3 000倍，有的可达35～40 mm[1]。

海岛棉（Gossypium barbadense，Gb）成熟棉纤比陆地棉（Gossypium hirsutum，Gh）长，但在开花后24 d，陆地棉纤维长度比海岛棉纤维长[2]棉纤维细胞的伸长开始于开花当天[3-5]，纤维细胞伸长速率最大的阶段发生在开花后6～12 d和15～20 d，两个阶段伸长量可达最终长度的80%[6]棉纤细胞伸长由细胞内膨压驱动，并伴以细胞壁松弛过程细胞内渗透溶质增加，促进细胞内渗透压增加，使细胞吸收大量水分，从而使细胞膨压增加，使细胞渗透压增加的溶质主要是可溶性糖、苹果酸盐及鉀离子（K+）[7]磷酸丙酮酸羧化酶（PEPC）[8]、胞间连丝[9，10]、蔗糖酶（Vacuelar invertase）[11]、水通道蛋白[12]与棉纤细胞膨压产生或增加有关棉纤细胞壁是由纤维素、半纤维素和结构蛋白组成的动态网络半纤维素木葡聚糖是植物细胞初生壁的结构多糖，木葡聚糖链通过共价氢键绑附到纤维素链上，将临近纤维素微纤丝交联起来[13]微纤丝之间木葡聚糖交联结构是细胞伸长的主要限制因素之一该交联结构可以被木葡聚糖转移/水解酶（Xyloglucan endotransglucosylase/Hydrolase，XTH）解开并重新连接，从而降低细胞伸长的阻力，因此XTH能通过松弛细胞壁进而促进细胞伸长。

重组拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）XTH14和XTH26加到根系上，展现出对根系细胞伸长明显的促进作用[14]在拟南芥中，超表达AtXTH18、AtXTH19、AtXTH20能刺激下胚轴伸长[15]；在棉花中，超表达GhXTH1能增强XTH活性，使棉花纤维长度增加15%～20%[16]XTH基因在棉花纤维中表达存在时间特异性和品种特异性[17]，在海岛棉和陆地棉花棉花纤维中表达存在差异[18]XTH基因表达模式与棉花纤维长度存在关联本研究从陆地棉中克隆分离两个XTH基因，对其进行序列分析、系统发生学分析和表达分析，以期为了解XTH基因及其家族与棉花纤维伸长之间的关系奠定基础，从而为棉花纤维品质改良特别长度品质改良提供候选基因1 材料与方法1.1 试验材料所用的棉花材料为陆地棉珂字201、华棉99，海岛棉为军海1号分别取开花后4、9、14、19、24 d棉瓣放入液氮，然后存入-80 ℃冰箱备用大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α为实验室保存，中间载体pMD18-T购于宝生物工程（大连）有限公司1.2 总RNA的提取与cDNA的合成棉花纤维总RNA用热硼酸法提取[19]，并按DNase I试剂盒所示方法处理总RNA，以去除其中DNA，然后用15 μL DEPC ddH2O溶解，分光光度计测定RNA浓度。

最后按照Promega反转录酶体系进行操作，合成第1链cDNA，反转录后的cDNA保存于-20 ℃1.3 GhXTH1和GhXTH2克隆在NCBI中有一个XTH全长编码序列（AY189971），另外还存在一个EST序列（DV848907）对于AY189971，根据其全长序列，从两端设计引物（GhXET-OE-F：5′-AAAGTCGACATTCTCTTTCTGTTTCTCTGGTTTA-3′；GhXET-OE-R：5′-AAAGGTACCTCAGATGATGGACATGCACTC-3′），以14 d棉花纤维cDNA为模板，PCR扩增后测序对于DV848907，将其与AtXTH序列比对，发现该段EST序列与AtXTH基因5′端同源程度较高，而且同源区包含起始密码子根据此段EST序列设计引物进行3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends），测序得到一段DNA序列，以该序列与EST序列拼接翻译，发现以EST序列的第三个碱基开始翻译能翻译出一个完整蛋白序列在该序列内存在两个起始密码子，以第一个起始密码子翻译到蛋白序列长度相对符合XTH蛋白序列长度RACE方法见参考文献[20]。

1.4 GhXTH生物信息学分析利用ClustalW软件进行多序列对齐和排序， 使用GenDOC和MEGA5.0软件输出同源比对和进化树构建结果[21]；用SingaIP进行信号肽预测[22]；用ProtParam计算蛋白质的相对分子质量和理论等电点[23]；利用TMHMM预测蛋白质的跨膜结构域 1.5 GhXTH1和GhXTH2表达分析UBQ7为RT-PCR分析内参基因，设计引物序列为：GhUBI-RT-F：GAAGGCATTCCACCTGACCAAC；GhUBI-RT-F：CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTGGhXTH引物序列为：GhXTH1-RT-F：TCCGTGACAGCAGATGAGATC；GhXTH1-RT-R：TGGTGCAAACTTAACTCCGACGhXTH2引物序列为：GhXTH2-RT-F：GGTTTCCGTGACAGCAGATG；GhXTH2-RT-F：GTGCAAACTTAACTCCGACATTPCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳2 结果与分析2.1 GhXTH1和GhXTH2全长序列克隆和分析GhXTH1在NCBI中存在一个全长序列（AY189971），根据该序列设计引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（图1A），片段大小在750～1 000 bp间。

测序结果表明，该序列与AY189971存在一个碱基差别，但蛋白序列完全相符将该基因命名为GhXTH1在NCBI存在GhXTH的一个EST序列DV848907，将该序列与拟南芥中XTH序列比对，发现该序列覆盖该基因的5′端，因此，仅需要进行3′-RACE可得到该基因全长序列，根据试剂盒（SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit）说明书，进行3′-RACE，扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳（图1B）将该片段测序，测序后所得序列与EST拼接，将所得序列在Premier软件进行翻译，发现从第3个碱基开始能翻译出一个蛋白序列以第一个起始密码子为起始，能翻译出289个氨基酸（aa）以编码该序列的DNA序列为模板设计引物，用该引物进行PCR扩增（图1C），对该片段进行测序，所得序列与前面的拼接序列完全吻合將该序列提交NCBI库（JN968478）2.2 GhXTH1和GhXTH2蛋白特征分析GhXTH1全长序列包含289个氨基酸，GhXTH2包含294个氨基酸将拟南芥和其他几种植物中XTH与克隆得到XTH多序列比对结果表明，棉花XTH序列与其他XTH序列有比较高的保守性，所有序列都存在维持XTH活性的保守序列DEIDFEFLG[24，25]，但有些序列与之相差1～2个氨基酸（图2）。

GhXTH1保守序列与此相差1个氨基酸，第3个氨基酸由异亮氨酸（I）变成了亮氨酸（L）；GhXTH2保守序列与此相差2个氨基酸，第1个氨基酸从天冬氨酸（D）变成天冬酰胺（N），第3个氨基酸从异亮氨酸变成苯丙氨酸（F）拟南芥XTH家族中多个XTH保守序列存在1～2个氨基酸变化XTH是一种细胞壁蛋白，因此，对所获得的两个棉花XTH进行信号肽预测、亚细胞定位预测及等电点等蛋白特征分析有助于了解其生物学功能经Protparam程序预测，GhXTH1理论分子质量33.07 ku，理论等电点（pI）为6.38，GhXTH2理论分子质量33.61 ku，理论pI为5.40通过SignalP 4.1 Server预测，显示GhXTH1和GhXTH2在N端均存在一段信号肽（图3），位置位于第1～25 aa该信号肽的作用是将该蛋白定位至细胞壁TMHMM预测GhXTH1和GhXTH2均存在1个跨膜结构（图4），该跨膜结构位于N端，在蛋白序列中信号肽的后面N-糖基化对维持XTH活性具有重要作用[26]用NetNGlyc 1.0 Server分析GhXTH1和GhXTH2中 N（天冬酰胺）-糖基化位点结果表明，GhXTH1存在1个糖基化位点，GhXTH2有两个糖基化位点，GhXTH1和GhXTH2保守序列DEIDFEFLG后面均存在1个糖基化位点。

2.3 GhXTH1和GhXTH2系统发育分析为了解GhXTH1、GhXTH2与拟南芥XTH之间进化关系，进行系统发育分析（图6）AtXTHs可以分3类，大部分Ⅰ类XTH成员包含4个外显子，Ⅱ类XTH成员具有2或3个外显子，Ⅲ类XTH成员具有4或5个外显子，且3类XTH C端存在特征序列[25]但随着AtXTHs与水稻XTHs（OsXTHs）叠加系统发生分析发现，Ⅰ类和Ⅱ类XTH成员分歧已不明显[27]；Ⅲ类显示具有木葡聚糖水解酶活性而不是转糖基酶活性[28]但酶活性分析表明Ⅲ类酶并不都具有水解酶活性，番茄中的一个Ⅲ类XTH（SIXTH5）表现出转糖基酶活性[29]因此，XTH系统发生学分类与其活性之间并无关系GhXTH1与AtXTH6、AtXTH亲缘关系较近，GhXTH2与AtXTH9亲缘关系较近，均属于Ⅰ/Ⅱ类XTH2.4 GhXTH1和GhXTH2在棉花纤维发育中的表达分析为获得两个XTH在不同棉花纤维中随发育时期的表达模式，用克隆到两个XTH序列设计引物，进行半定量分析，以了解两个XTH在陆地棉和海岛棉棉花纤维发育中的表达模式（图7）结果表明，GhXTH1和GhXTH2在陆地棉和海岛棉表达量均随着棉花纤维发育而下降。

在棉花纤维发育的初生壁时期，细胞伸长较快，XTH大量表达能松弛初生细胞壁进而释放因细胞伸长而产生的阻力在陆地棉和海岛棉中，GhXTH2表达量比对应发育时期GhXTH1表达量高3 讨论利用传统PCR技术和RACE技术，从棉花纤维中分离到两个XTH基因，分别命名为GhXTH1和GhXTH2序列比对发现它们均存在XTH家族保守基序DEIDFEFLG，该基序不仅在XTH家族中保守，在XTH所隶属的GH16家族中也相对保守[30，31]从拟南芥和水稻XTH家族保守序列看，该基序在某些位点有些变化因此，GhXTH1和GhXTH2在该基序上有1～2氨基酸残基变化不影响其成为XTH家族成员 拟南芥XTH家族包含33个成员，从系统发生学角度可分为3类[32]，GhXTH1和GhXTH2均属于其中Ⅰ类（Group Ⅰ/Ⅱ）Ⅰ类XTH具有一个共同特征，XTH基因由4个外显子组成，其保守基序位于3个外显子上但系统发育分类与XTH活性无关[29]，。