土壤中放线菌的分离和纯化实验.doc

土壤中放线菌的分离和纯化实验一、 实验目的1、 制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法2、 掌握培养基的灭菌方法掌握外植体的消毒和超净工作台的使用4、 掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、 掌握高氏一号培养基的配制方法；6、 复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽 灭菌锅7、 培养微生物实验的设计思路和动手能力二、 实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、洒精 棉球、镊子、电子天平、称景纸、烧杯、景筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接 种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、 实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞 具右全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、 花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等） 或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，在无菌和适 宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、 不定根，最后形成完整的植株的学科U!1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、 活性炭8半勺、琼脂80g、配制 母液。

2、配制培养液时应注意：① 在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放 母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即 淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液 放在冰箱里4C保存；② 用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量简 或移液管润洗2次；③ 量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1 种，划掉1种，以免出错溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗 糖30g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电 炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状然后再将配 好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL,搅拌均匀需要注意的是，在加热琼脂，制备培养基的过程中，操作者千万不能 离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要秉新称量、制备此外，如果没 有搪瓷量杯，可用大烧杯代替但要注意大烧杯底的外表面不能沾水， 否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤调pH用滴管吸 取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH，一直调到培养基的 pH为6 （5.8〜6.5）左右为止。

培养基的分装溶化的培养基应该趁热 分装分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入 锥形瓶（50 mL或100 mL）中注意不要让培养基沾到瓶U和瓶壁 上锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5〜1/4每1 000 mL 培养基，可分装25〜30瓶培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口 用2块硫酸纸（每块大小约为9 cmX9 cm）中间夹1层薄牛皮纸封 盖瓶口，并用线绳捆扎最后在锥形瓶外壁贴上标签3、高压灭菌培养基的高压灭菌包括以下儿个步骤第一，码放锥形瓶将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放 入高压蒸气灭菌锅内如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放 一块玻璃板隔开第二，放置其他需要灭菌的物品将其他需要灭菌的物品也放入高压 蒸气灭菌锅内，如装存蒸馏水的锥形瓶、带螺U盖的玻璃瓶、烧杯、 广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用报纸包裹的培养皿、剪刀、 解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等第三，灭菌待需要灭菌的物招码放完平•，盖上锅盖在98 kPa、121 C 下，灭菌20 min灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固后再使用4，、再在操净工上进行消毒，先用紫外线照射30MIN，然后送风，关 闭紫外灯，改用口光灯，对手用酒精进行消毒，对培养基表面也要 用酒精进行消毒。

准备工作好了，就进行接种并且要在酒精灯旁边 进行操作，避免污染镊子要在双孔灭菌器上进行灭菌4、接种完成后要整理工作台，并且把培养瓶拿到培养架上进行曰光培养五、放线菌的提取步骤5、（ 1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或 孢子均匀分散静止20-30s，标记为编号16、 （2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度）①取 3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、 4.②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml 土 壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中 移取0.5ml 土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，7、 分别将土壤悬液制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、 10-8、10-9、10-10 的土壤稀释液六、稀释涂布法分离土壤中放线8、 （1）倒平板9、 将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55— 60C时,往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾，然后分别倒 平板。

方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁 边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出 令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝， 迅速倒入焙养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分 布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板共制备6个平板（一个稀释 度做3个平行样品）10、 （3）涂布平板11、 用lml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液 lml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板用 无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在 整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌12、 （4）倒置平板13、 将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d14、15、 5、放线菌的纯化16、 （1）倒平板同上17、 （2）平板划线18、 将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一 次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下 一次划线划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养6、放线菌的观察玻璃纸法19、将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。

20、 将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿 倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸 履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基21、 （3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种22、 （4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30C下培养23、 （5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿在超净 工作台上，打幵培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌 剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察7、放线菌保藏斜面低温保藏法长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8 1的冰箱中保藏，保存2 一4个月，移种一次将纯化培养后的放线菌接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生。