全内反射荧光成像基本原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,全内反射荧光成像基本原理,Total Internal Reflection Fluorescence,(TIRF),全内反射荧光显微镜,(TIRFM),目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描探针显微技术（,SPM,）和光学技术其中：,SPM,原子力显微技术（,AFM,）,扫描离子电导显微技术（,SICM,）,扫描隧道显微技术（,STM,）,光学技术,光学显微镜成像,光学操纵,共聚焦荧光显微技术,（,LSCM,）,扫描近场光学显微技术,（,SNOM,）,全内反射荧光显微技术,（,TIRFM,）,上世纪,80,年代，,Axelrod,等生物物理学家对,TIRFM,技术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用发展历程,Axelrod,Julius,阿克塞尔罗德（,Axelrod,Julius),美国生物化学家及药理学家1970,年他与卡茨冯奥伊勒共享了,诺贝尔生理学和医学奖,于美国卫生研究院度过其大部职业生涯他研究药物及激素的作用、神经冲动传播的化学方面，并特别研究松果体的功能光反射和折射示意图,全内反射示意图,n,1,n,2,Refracted,TIR,n,1,n,2,光的反射和折射,Snell,定律：,当入射角不断增大，透射角为增大,90,时，入射角达到临界角,c,。

依据,Snell,定律得出：,当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发生了全内反射90,n,1,n,2,TIR,实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一部分透过的能量场则称之为,“隐失波”,或“隐失场”,隐失波,90,n,1,n,2,TIR,隐失波,隐失波的频率与入,射光线的频率相同，其强度随临界面的垂直距离呈指数衰减：,其中：,Z,是离开分界面的距离，,I(z),表示距离界面,Z,处的强度；,I(0),表示临界面处的强度由于隐失波仅在界面上,极薄的一层,范围内传播，所以利用隐失波照明样品，可以仅激发厚度,大约,100nm,内的荧光团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了显微成像的对比度和信噪比d,12,是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减,l/e,处的距离隐失波的渗透深度,d,12,是入射角及相对折射率的函数d,12,是渗透深度,它等于从分界面处到光强衰减到分界面处数值,l/e,的处的距离对于可见光波长而言，浸透深度约为,100 nm,隐失波强度成指数衰减曲线,隐失波存在的实验证明,两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层,(,光疏媒质,),。

如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射波,这透射波进人第二块棱镜光学隧道效应,光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质,2,中当光疏介质薄膜的厚度,小于隐失波的渗透深度,时,这个波不仅穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质,3,中的电子作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生了显著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学,隧道效应,的产生全内反射荧光显微技术，是利用光发生,全内反射,时产生的,隐失波,照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在,Z,轴上的空间,分辨率,得到了显著改善，大大提高了图像的,信噪比和对比度,全内反射荧光显微成像系统,分子荧光的产生,当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量子发生“碰撞”如果这次碰撞时有效的,：,吸收,hv,放热,H,放热,H,*,*,荧光,hv,S,2,S,0,S,1,放出热量,H*,激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大荧光：,10,-7,-10,-9,s,磷光：,10,-4,-100s,分子荧光的产生,电子跃迁的单重态,（,单线态）,与,三重态,（,三线态）,在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（,n,）处于不同的自旋状态，通常用多重态,M,来描述：,M,2S,1,1,电子自旋的大小用自旋量子数,S,表示，,S,可为,+1/2,或,1/2,，这里的正负号取决于自旋的方向。

基态中每个能级通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，,M=1,，成为单重态当成对电子中的一个被激发到,S,1,、,S,2,等电子能级激发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子成对这些能态都被称为单线态或,单重态,(singlet state),但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电子通过无辐射跃迁（系间跨越，,intersystem crossing),改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至另一种激发态：,S,1/2,1/2,1,，多重度,M,2S,1,2,1,1,3,，这种电子激发态称为,三重态,(triplet state),能量,S,0,单重基态,S,1,单重激发态,T,1,三重激发态,分子荧光的产生,（雅布隆斯基分子能级图）,荧光发射：,电子由第一激单重态的,最低振动能级,到基态，多为,S,1,-S,0,由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，,荧光的特征波长比入射波长要长,荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：,10,-9,10,-7,s,，又叫快速荧光或瞬时荧光外部光源停止照射，荧光马上会消失磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（,10,-4,10s,），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。

分子荧光的产生,目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类型：,棱镜型和物镜型,(,或无棱镜型,),棱镜型,全内反射荧光显微镜结构,全内反射荧光显微镜结构,物镜型使用高数值孔径,(NA1,4),的物镜作为荧光信号的接受器，同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并且可与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等该系统的关键是高数值孔径物镜的使用由于细胞的典型折射率为,1,33,1,38,，因此要实现全内反射，物镜的,NA,必须大于,1,38,，表达式为：,NA=n sin,n sin,n sin,c,其中，,NA,为物镜的数值孔径,，,n,，,分别为物镜的折射率,(,浸没油,),和孔径角c,为发生全内反射时的临界角物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且,容易校准光束物镜型全内反射荧光显微镜示意图,。