临床血液学检验第3讲细胞化学染色.ppt

细胞化学染色n概述n一.铁染色（Fe）n二.中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）n三.过氧化物酶染色（POX）n四.苏丹黑染色（SBB）n五.过碘酸－雪夫反应（PAS，糖原染色）n六.酯酶染色概述 1.细胞化学染色定义： 根据细胞化学原理显示、观察、研究细胞内酶类及其他化学成份的方法 2.显示内容： 酶类、脂类、糖类、蛋白质、核酸、铁元素 3.目的与作用：区分细胞（两种性质完全不同的原始细胞，形态极其相似）进行细胞化学染色后，差别出现n3.目的与作用n（1）鉴别细胞：POX、PAS、SB、酯酶染色n（2）鉴别疾病：Fe，NAP，需定量n（3）观察疗效n4.染色步骤（1）固定（2）显示（3）复染保持细胞结构及化学成分不变蒸汽固定：甲醛液体固定：甲醛、甲醇、乙醇、丙酮形成稳定的有色沉淀，显示被检物质增加反差，便于观察一、铁染色原理：普鲁士蓝反应n酸性环境下：nFe+++ + K4［Fe（CN）6］→Fe4［Fe（CN）6］3 含铁物质 亚铁氰化钾 亚铁氰化铁（蓝绿色）n观察幼红细胞内、髓小粒上和吞噬细胞内有无蓝绿色颗粒或小块。

染色结果：n1.细胞外铁：n体内贮备铁的形式，实质是铁蛋白或其聚合体，髓小粒上的颗粒状、小珠状、团块状兰绿色物质，也可在吞噬细胞内n反映铁储存情况细胞外铁（左：髓小粒贮存铁，右：巨噬细胞吞噬）细胞外铁半定量：n无　　　　　　（－）n弥散状　　　　（＋）　　　n颗粒状　　　　（＋ ＋ ）n小珠状　　　　（＋ ＋ ＋ ）n团块状　　　　（＋ ＋ ＋ ＋ ）n2.铁粒幼红细胞（细胞内铁）：幼红细胞浆内有兰绿色颗粒反映铁利用情况n3.环形铁粒幼红细胞（1）幼红细胞内（2）6个以上铁颗粒（3）绕核排列半周以上n4.铁粒红细胞含铁颗粒的成熟红细胞细胞内铁分级n幼红细胞内的铁，计数100个幼红细胞，记录浆内有兰绿颗粒的阳性细胞百分率nⅠ型：1~2个铁颗粒nⅡ型：3~5个铁颗粒nⅢ型：6~10个铁颗粒nⅣ型：含11个颗粒以上n环形铁粒幼红细胞正常参考值：n外铁：（+）~（++）n内铁：铁粒幼红细胞19%~44%，Ⅰ型多见，少数Ⅱ型无环铁和铁粒红细胞临床意义n1.IDA：外铁（—），内铁明显减少或无n2.铁粒贫：内铁增多，颗粒大，环铁增多n3.MDS-RAS：类似于铁粒幼细胞性贫血n4.感染、肝硬化、慢性肾炎等继发性贫血：内铁减少或无，外铁不减少二.中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）成熟中性粒细胞特异性颗粒内的一种酶。

1.偶氮耦联法原理：nPh9.2~9.8时，nNAP水解 重氮盐 n ↓ ↓ 磷酸萘酚钠→ 萘酚 →有色沉淀 偶氮耦联法阳性结果2.钙钴法原理：n Ph9.6时，n NAP水解 Ca++ CO++n ↓ ↓ ↓β-甘油磷酸钠→ PO43－ →磷酸钙→ 磷酸钴↓+硫化铵 →COS↓（棕黑色、灰黑色）正常反应细胞nALP仅存在于中性杆状核、分叶核粒细胞和巨噬细胞内，其余细胞（—）n定量：只计算中性杆状核、分叶核粒细胞的ALP相应含量，称NAP定量定量方法：n油镜计数100个中性杆、分叶核粒细胞，分别记录分级情况，最后计算阳性率和积分反应分级特征得分个数积分—无灰黑色0100+1/4灰黑或浆浅灰12020++1/2灰黑或浆灰色24080+++充满灰黑色32060++++充满黑块41040阳性率：90%总积分：200NAP阳性级别NAP积分参考值：n资料1：n男性成人： 阳性率：3%~50%，积分：3~73分n女性成人： 阳性率：15%~70%，积分：17~145分n资料2：nNAP积分参考范围：14~113分n各实验室应有自己的参考值。

临床意义：n1.鉴别感染类型n NAP活性与粒细胞的成熟程度、感染程度、感染类型有关，与肾上腺皮质激素水平有关n细菌感染：NAP↑，球菌>杆菌，急性> 慢性n病毒感染：无变化或减低2.血液病鉴别：（1）急性白血病：ALL：↑↑急粒：↓，伴细菌感染可↑ 急单：一般↓，也可正常 （2）慢性白血病： CLL：↑↑ CML：0分 （3）白血病愈后： ALL、CLL好转：↓，缓解后正常 CML好转：↑，缓解↑→正常血液病鉴别：n(4). 常见疾病鉴别n(1)PNH↓，AA↑n(2)真红↑，继发性红细胞增多：无变化n(3)类白反应↑↑，CML降低n(4)恶性组织细胞病↓，反应性组织细胞增多↑↑n(5).存在生理性波动n（1）年龄：婴儿、儿童高，老年人低n（2）性别：成年女性高于男性，经期和妊娠期高n（3）应激状态：增高三.过氧化物酶染色（POX）n原理：n细胞溶酶体颗粒中POX能使供氢体“无色联苯胺”脱氢氧化为联苯胺蓝，同时氢传递给H2O2生成水，联苯胺蓝与“亚硝基铁氰化钠”进一步结合生成更稳定的蓝绿色物质沉淀于酶活性部位POX染色阳性效果正常细胞反应n1.粒细胞：n原粒→早幼粒→中性中幼粒→中性分叶核 嗜酸粒 嗜碱粒(-、±、+) （++） （++++） （++++） （+++）颗粒多，粗 （-）n2.单核细胞：n原单→ 幼单 → 成熟单 （—） （±） （±）颗粒稀疏，量少n3.淋巴细胞、幼红、巨核细胞、血小板、浆细胞均（—）原始粒细胞POX染色：阳性早幼粒细胞POX：强阳性单核细胞POX：阴性或弱阳性淋巴细胞POX阴性临床意义：n急性白血病类型鉴别n急粒白血病：原粒，小原粒（+），早幼粒(+++)n急淋白血病：原、幼淋（—）n急单白血病：原、幼单（—）或（±）n组织细胞白血病、恶性组织细胞增多症：（—）恶性组织细胞POX：阴性四.苏丹黑染色（Sudan Black B）n原理：nSBB是一种脂溶性染料，能溶解于细胞内含脂结构，而使脂类物质（中性脂肪、磷脂、类固醇）显示出来，呈棕黑色或深黑色。

n正常反应细胞：同POX 个别淋巴细胞也可呈阳性反应临床意义： 基本同POX 敏感度高于POX 适于陈旧涂片的补救SB染色效果五.过碘酸-雪夫反应（PAS）n又称糖原染色n原理：n过碘酸是强氧化剂，能将胞浆内的多糖类物质的乙二醇基氧化形成双醛基，醛基与无色品红结合形成紫红色化合物定位在胞浆内PAS染色效果正常反应细胞－1n1．粒细胞：n原粒→早幼粒→中性中幼粒→中性分叶核 （－ +） （+＋） （++++） （++++） 特征：弥散状紫红色 n嗜酸粒：颗粒（—），浆红色n嗜碱粒：颗粒（+），大小不一的紫红色，浆不着色n2．单核细胞：n原单→幼单→成熟单 （—） （+） （++） 特征：弥散状紫红色n3．淋巴细胞：n大多数（—），少数呈（+） 特征：粗颗粒状或块状紫红色n4.幼红细胞、成红细胞：（—）n5.巨核细胞：（+）颗粒状、块状紫红色n 血小板：（+）细颗粒或小块状紫红色n6.浆细胞： （—），少数（+）颗粒状n7.巨噬细胞：（+）细颗粒状粒细胞和淋巴细胞的PAS染色巨核、网状、成骨、破骨的PAS临床意义：n1.白血病的鉴别 急淋：淋巴细胞：粗颗粒或块状阳性，机会较多 急粒：原、早粒细胞：红色弥散状阳性 急单：原、幼单细胞：红色弥散状阳性n2.红系统的恶性疾病n红血病、红白血病、MDS的幼红细胞内可见块状或大块状阳性。

ALL淋巴细胞POX、PASALL淋巴细胞POX、PASM6的红细胞的PAS染色六.酯酶染色法n血细胞含有多种酯酶及其同功酶n根据反应时pH不同分为酸性、中性和碱性酯酶n根据鉴别细胞的特异性程度分为特异性酯酶和非特异性酯酶1.特异性酯酶—氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色法(AS-D NCE) 2.非特异性酯酶—中性α-醋酸萘酚酯酶染色法(α-NAE) 1.氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色法(AS-D NCE)n原理：n细胞浆内AS-D NCE水解氯乙酸AS-D萘酚，产生的AS-D萘酚与偶氮染料坚牢蓝紫酱GBC结合产生红色不溶性沉淀，定位于酶所在部位2.α-醋酸萘酚酯酶染色（α-NAE）n原理：n细胞浆内α-NAE水解α-醋酸萘酚，产生的α-萘酚与坚牢蓝B结合生成灰黑或棕黑沉淀，定位在酶部位nNaF抑制试验：α-NAE属同工酶，单核细胞内的酶活性可被NaF抑制NAE和NAE＋NaF的染色效果正常反应细胞AS-D NCEα-NAE粒细胞酯酶单核细胞酯酶 原粒 → 早幼粒→中性分叶（—、+） （+） （+）E:阴性、弱阳性B:阳性原单 → 幼单→ 成熟单（±、+） （++） （++） NaF可抑制单核细胞：（—）淋巴、浆、巨核、幼红、血小板均（—）肥大细胞：阳性粒、淋：（－、±、+） 巨核、血小板（+）幼红：大多(-)，少数(+)浆细胞：（－）NaF不可抑制单核细胞的NAE一例单核细胞白血病的POX和NAE染色几种NAE阳性细胞酯酶双染色同一张涂片上进行AS-D NCE和α-NAE 染色。

临床意义鉴别白血病 NAS-DCE NAE NAE+NaF急粒： ++~+++ + 不抑制急单： － +~+++ 抑制急粒、单： 粒+、 单－ ++ 部分抑制急淋： － －~± 不抑制 重点内容n1. 常用细胞化学染色的原理及临床意义： Fe、 NAP、 POX、PAS、NAEn2.名词：细胞内铁，细胞外铁，环形铁粒幼红细胞。