我做了很久的western blot.doc

我做了很久的western blot，尤其是phospho-抗体，可以算是达人了我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之western blot提出以下建议，供刚入门的同仁参考：1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分4度也可使一抗重复使用多次毕竟磷酸化的抗体都挺贵的二抗则室温1小时即可3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST4.抗体的稀释倍数也要适当不同厂商也会有不同要求5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。

个人整理 Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面） 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml)储于棕色瓶，4℃避光保存严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制如有沉淀，可以过滤2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积过滤后4°C保存4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积过滤后4°C保存这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、 TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合PH太低时，聚合反应受到抑制AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液： 称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存7、 SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍PH8.39、 转移缓冲液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L10、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液使用后应予以废弃11、 脱脂奶粉5%(w/v)12、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)4.2.4  22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液：分离胶12.5% ,PH8.8 5ml 10ml 15ml超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 mlpH8.8、1.5mol/LTris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 mlTEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml10%过硫酸铵 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml浓缩胶：5% ，pH6.8   2 ml  4 ml  6 ml超纯水  1.4 ml  2.8 ml  4.1 ml30%丙烯酰胺溶液  0.3 ml  0.6 ml  1.0 mlpH6.8、1.0mol/LTris溶液  0.25 ml  0.5 ml  0.75 ml10%SDS  0.02 ml  0.04 ml  0.06 mlTEMED  0.002 ml  0.004 ml  0.006 ml10%过硫酸铵  0.02ml  0.04ml  0.06ml一．配胶1．  注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2．  分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可3．  封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS封胶后切记，勿动待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

二．样品处理1．培养的细胞（定性）：⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer⑶ 100℃，1min⑷ 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样⑹ 待样品恢复到室温后上样2．培养的细胞（定量）：⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）⑵ 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min⑶ 用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次⑷ 12000g离心，4℃，2min⑸ 取少量上清进行定量⑹ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。

3．组织：⑴ 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液可手动或电动匀浆注意尽量保持低温，快速匀浆⑵ 12000g离心，4℃，2min⑶ 取少量上清进行定量⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min三．电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束四．转膜1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。

PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中将滤纸也浸入转移液中2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧降温，将电泳槽置于冰水混合物中恒流100mA过夜，或400mA，4h注意不同蛋白的要求不同干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时负载电压不宜超过1V/cm2胶面积五．封闭及杂交1．封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步2．结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。

反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发3．洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时5．洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min六．发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法1．HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描2．AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个 EP管中，每张3×9cm的膜取一。