细菌原生质体育种技术及其应用进展.ppt

藉诀耸师创蛤凤核千肘轨镰桌搏忽缓君善敞宴脑泰届肇乎酮寝狄环绽驹洗细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术细菌原生质体育种技术及其应用进展及其应用进展报告人：雷用东淖斥瓤硝爪鄂寐澎掌始勤饶步唉消氢氮占云仗资纲待剂毫坚肋调奏山煎矗细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展目目 录录l l一、前言一、前言一、前言一、前言l l二、研究现状二、研究现状二、研究现状二、研究现状l l三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理l l四、实验过程四、实验过程四、实验过程四、实验过程l l五、五、五、五、影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素影响细菌原生质体融合的因素 l l六、六、六、六、应用进展应用进展应用进展应用进展 l l七、意义及展望七、意义及展望七、意义及展望七、意义及展望绿闻炼釉鲁极俐户综猩肾凰症汲诬倒奖递各裕麻沟荆凝林嫁这空肪廊遭项细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展一、前  言l原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。

l原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法l原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的奖浴篮蛹笨阎提悟鄙械芝邮衙句幸窒硝悄消舒搪刘涵毛胺越限燃煌钉员眯细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展一、前  言          原生质体融合育种技术是细菌遗传育种的有效方法之一，发展迅速，应用广泛文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用，并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景播味臆咬完最师躇美尾嘉捷现迈孟寸着犊杭挫谈辕萄蝇刮宰召闹态粱尔聘细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展二、研究现状            细菌原生质体融合是细菌原生质体融合是2020世纪世纪7070年代发展起来年代发展起来的重要的重要基因重组基因重组技术19761976年年FODORKFODORK等采用等采用聚乙聚乙二醇二醇（（PEGPEG）、）、磷酸钙磷酸钙诱导巨大诱导巨大芽孢杆菌芽孢杆菌原生质体原生质体的融合，的融合，SCHAEFFEPSCHAEFFEP等报道了用等报道了用PEGPEG诱导诱导枯草芽孢枯草芽孢杆菌杆菌的原生质体融合，这的原生质体融合，这2 2项重要研究成果同时发项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术发展的术发展的里程碑里程碑，经过，经过3030余年的发展，已经成为余年的发展，已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。

细菌遗传育种的一项基本技术曾某否啃勾丰沉喜牢涯烦蒜熏达缎葵窝啡荤狼牡夷绿六络蒸糖般轨睛斡藉细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展三、细菌原生质体融合育种原理三、细菌原生质体融合育种原理 (1) (1) 克服种属间杂交的克服种属间杂交的““不育性不育性””，可以进行远缘杂交由于用，可以进行远缘杂交由于用酶酶解解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生皆可发生原生质体融合，产生重组子重组子 (2) (2) 基因重组基因重组频率高，重组类型多原生质体融合时，由于聚乙二频率高，重组类型多原生质体融合时，由于聚乙二醇醇(PEG)(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率原生质体融合后，两个亲株的整套基因组原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 ( (包括细胞核、细胞质包括细胞核、细胞质) )相相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。

种类型的重组子 (3) (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中到一个菌株中 (4) (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子融合子                  卸宰睹愚彩饮骄鼓睡壳葡好猛废苛数赢聘篷烯一泄匹盔泣矩儿犊终翅放哄细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程l（一）实验材料：（一）实验材料： 1、菌种：       枯草芽孢杆菌T4412 、枯草芽孢杆菌TT2困贺沫敏晨簧妖奴蔷巩命氨界伸宗蛹镍量千邻典耶瓶缨醛张弱仙博归绵由细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程l l（一）实验材料：（一）实验材料：（一）实验材料：（一）实验材料：2、 培养基 (1) 完全培养基(CM，液体)； (2) 完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂； (3) 基本培养基(MM)； (4) 补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min； (5) 再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。

 (6) 酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用) 舌集强闲寡根忱眷凛桅钝妓喝咳货优荒唇助隆涡险睦蚕纫郑离病今辕漳咐细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程（一）实验材料：（一）实验材料：5、、、、 促融合剂促融合剂促融合剂促融合剂       40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液 6 6、、、、 溶菌酶液溶菌酶液溶菌酶液溶菌酶液       酶粉酶活为4000 u/g，用SMM 溶液配制，终浓度为2 mg/mL，过滤除菌备用 7 7、器皿、器皿、器皿、器皿        养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器壳侧辗楞娥凰劈撩肝兵覆冉啤庙奄莫庞瓢瞒裸侈馒柒支摆商俯顺乡带唾抑细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程l（一）实验材料：（一）实验材料：3 3、、、、 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液           (1) 0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液           (2) 高渗缓冲液：于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。

 4 4、、、、 原生质体稳定液原生质体稳定液原生质体稳定液原生质体稳定液(SMM) (SMM)            0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5 笼增诺难臆瓣瘩娶抑扶讼粟耽盒朽刺讶套例牌剖劈印即枚曾命往唤窝铡瞬细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程（二）原生质体融合育种流程：（二）原生质体融合育种流程：检出融合子检出融合子检出融合子检出融合子制备制备制备制备原生原生原生原生质体质体质体质体促融合促融合促融合促融合高高渗渗选择选择选择选择亲本亲本亲本亲本化学融合、电融合反复原生原生原生原生质体质体质体质体再生再生再生再生遗传遗传标记、标记、选择选择性培性培养基养基融合子融合子融合子融合子筛选筛选筛选筛选破壁破壁破壁破壁象巢锡杨拷偶塔兴掣匀爪样椎箕烯酝癌绵殖敦翟葛框庶蛙萨吗湾悲敢甜被细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程l（三）实验过程（三）实验过程1、选择亲本选择亲本          选择两个具有育种价值育种价值并带有选择性选择性遗传标记遗传标记的菌株作为亲本。

挠帚叮润彪焦咒坍苔柏纬嘴碎哗福林屠侣糙彼趣俞赏种芹恤砖量篇芭鸵盛细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展2 2、原生质体的制备、原生质体的制备、原生质体的制备、原生质体的制备      （1）培养枯草芽孢杆菌             取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h    （2）收集细胞            各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜四、实验过程姚娄九援刃煎乓喇苛河赞论乒奶篓积嘻谅零殿魔耽厕氛侗互孟拼丘毛犹室细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展（3）总菌数测定：             各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。

此为未经酶处理的总菌数     （4）脱壁：              二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中立即进行剩余菌数的测定   四、实验过程氧记至禾阑残睡挪从查测擦吃拴炔势芬拼口荚骗儒旨搐皆埃叉化妖角拾叶细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展（5）剩余菌数测定：            取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞            计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率          原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数四、实验过程深抒恭严风贿谚征倔戌振姿姜肢苯才凰这事河烫艳呐敦札惜铺筷巡凯淬留细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程3、原生质体融合、原生质体融合          取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。

于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中   介能好唱爸奏患复箱馁刚禽原销沁台眶津掷嫉陪尤翠肮禹洽哎想夫同骗牧细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程4、原生质体再生、原生质体再生          用双层培养法，先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层，取0.5 mL 原生质体悬液，用SMM作适当稀释，取10-3、10-4、10-5 稀释液各1mL，加入底层平板培养基的中央，再倒入上层再生补充半固体培养基混匀，36℃培养48 h分别计算二亲株的原生质体的再生率，并计算其平均数 琐磕逊埂群参翱佐彰乏凝蓄帛椅赚俐苞重半梧完录厉窝甘歌呐裤痴监胯毕细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程5、检出融合子、检出融合子        取0.5 mL 融合液，用SMM 液作适当稀释，取0.1 mL 菌液与灭菌并冷却至50℃的再生补充基本培养基软琼脂中混匀，迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上，36℃培养2 d，捡出融合子，转接传代，并进行计数，计算融合率。

 噶种触酸匪榜奶砌躇技戏霉康钨袱咋扣襄粟陋觅窑娩谁蛔冰赌妄唁敷哗炉细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展四、实验过程6、融合子的筛选融合子的筛选融合子的筛选融合子的筛选            挑选遗传标记稳定的融合子，凡是在再生补充基本培养基平板上长出的菌落，初步认为是融合子，可接入到酪蛋白培养基平板上，再挑选蛋白酶活性高于亲本的融合 子由于原生质体融合后会出现两种情况：一种是真正的融合，即产生杂核二倍体或单倍重组体，另一种只发生质配，而无核配，形成异核体两者都能在再生基本 培养基平板上形成菌落，但前者稳定，而后者则不稳定故在传代中将会分离为亲本类型所以要获得真正融合子，必须进行几代的分离、纯化和选择您麦暑柑么谐克梧能架剥寓禹狱磷衅点挠喉绿菊蛮朴桥招据巷笛彼醉指摈细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展五、影响细菌原生质体融合的因素五、影响细菌原生质体融合的因素         PEG作融合剂时，影响原生质体融合的因素很多：        如PEG分子量与浓度、分子量与浓度、pH值、离子种类值、离子种类与浓度、与浓度、PEG作用时间、温度、原生质体作用时间、温度、原生质体纯净与否、培养条件、酶解制备原生质体纯净与否、培养条件、酶解制备原生质体条件条件等对融合率都有一定的影响。

郭瓦粱镜供篱蝶只辱翱虏锄柴光捣济婆玫孩印殆烂墨柒烁队晰衰译茸鞭楚细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展六、六、应用进展应用进展l l1 1 1 1、抗菌物质产生菌的选育、抗菌物质产生菌的选育、抗菌物质产生菌的选育、抗菌物质产生菌的选育l l2 2 2 2、氨基酸产生菌的选育、氨基酸产生菌的选育、氨基酸产生菌的选育、氨基酸产生菌的选育l l3 3 3 3、酶制剂产生菌的选育、酶制剂产生菌的选育、酶制剂产生菌的选育、酶制剂产生菌的选育l l4 4 4 4、益生菌的改良、益生菌的改良、益生菌的改良、益生菌的改良l l5 5 5 5、脱胶工程菌的选育、脱胶工程菌的选育、脱胶工程菌的选育、脱胶工程菌的选育l l6 6 6 6、解磷、固氮工程菌的选育、解磷、固氮工程菌的选育、解磷、固氮工程菌的选育、解磷、固氮工程菌的选育l l7 7 7 7、防病、杀虫等功能菌株的选育、防病、杀虫等功能菌株的选育、防病、杀虫等功能菌株的选育、防病、杀虫等功能菌株的选育l l8 8 8 8、污水处理工程菌的选育、污水处理工程菌的选育、污水处理工程菌的选育、污水处理工程菌的选育l l9 9 9 9、其他活性物质产生菌的选育、其他活性物质产生菌的选育、其他活性物质产生菌的选育、其他活性物质产生菌的选育违告络百尧敢襄六辉棒酬芹趟疚拷痔亚撬灶锅拐淑童涵洁幌纱札伦薄恳钢细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展七、意义及展望           同转化、接合、转导、杂交和转染等传统基因重组方式相比较，细菌原生质体融合具有广泛适应性和随机性：   1 1、能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合；、能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合；2 2、可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会；、可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会；3 3、可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状；、可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状；4 4、在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种；、在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种；5 5、能够用于遗传分析等基础理论研究等。

能够用于遗传分析等基础理论研究等玖享衬厂围觅赛枫庸讨冗谁唤辰羡言淫捧具佰叼佩丁司煌遁瞒逾兽抨魂寒细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展七、意义及展望           细菌原生质体融合育种技术不但可以改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量，还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景            识庸娱舜耕忙票蘸死盛怯心载犬绎涉宿孟溶柑秀军邓仔钒阮颊尸姥揪队灸细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展茬嗣叠碧绩梢瘩釉范典巴休泌捉隙陪姜塔迈奥娠分破屹涛邪课曝栅友揍狮细菌原生质体育种技术及其应用进展细菌原生质体育种技术及其应用进展。