看透本质：利用活体成像技术洞悉复杂生物学现象.docx

          “看”透本质利用活体成像技术洞悉复杂生物学现象                    撰文·供图 杜茁从最早发现生命体的基本构造单元——细胞，到最新的观测细胞内单个分子的行为与变化，显微镜技术日新月异的发展不断推动着生物学研究迈向更深的层次当今，借助显微镜，生物学家不仅能静态地观察生物体在细胞与分子水平精细的排布和组织构造，还能动态地追踪生物体在生长与发育过程中大量细胞和分子的行为、功能和调控过程活体成像技术的不断发展与完善为研究复杂生命现象提供了一利器活体成像不仅能实时记录复杂生物学过程的发生和发展，通过结合分子生物学、荧光标记和定量分析技术，生物学家们还可以利用活体成像定量地分析分子和细胞的在生命活动全过程中的行为和调控，而实现在体内生理条件下探究生命现象的本质通过进一步联手光遗传学技术，还能特异操控单个细胞和单个蛋白分子的行为与功能，而实现对生物系统的功能进行干预和操控全景式洞察活胚胎整体发育单个受精卵如何经由发育过程而形成结构复杂、功能完备、绚丽多姿的生物体呢？这是发育生物学家长期探寻的重大课题4D活体成像技术能实现高分辨率地记录整个动物胚胎从受精卵开始，随时间推进中，每一个细胞的分裂、分化和迁移的过程，而极大地扩展了研究人员的观察视野。

活体成像能高保真地捕获每一个胚胎细胞在每一时刻的行为，使得全景式地分析活体发育过程成为可能例如，利用转盘式激光共聚焦荧光显微镜，美国华盛顿大学和斯隆凯特琳( Sloan Kettering)研究所的研究人员实现了精确捕获模式生物秀丽隐杆线虫胚胎从单个细胞到孵出的整个过程他们利用荧光蛋白标记细胞核，观测和分析发育过程中所有的细胞的分裂、迁移和凋亡过程通过进一步对海量4D图像信息的全自动图像处理，研究人员不仅能够构建整个发育过程的细胞谱系，还能分析细胞周期的调控、细胞分化，追踪感兴趣细胞的发育动态行为，以及分析多个细胞的相互作用和协同在形态建成过程中功能此外，通过优化显微技术和样本处理方法，来自加州理工和霍华德休斯医学院珍妮雅法姆研究学院( HHMI Janelia Farm)的研究人员实现了对多种更为高等的动物胚胎的高质量活体成像过程目前，研究人员能够捕获果蝇、海胆、海鞘、斑马鱼等多种动物胚胎的整个或部分的发育过程，极大地推动了模式生物发育研究广度和深度http://ww w.janelia.org/digitalembryo网站提供了多种动物胚胎发育过程的影像和定量分析，供感兴趣的读者进一步参考。

上述这些生物的胚胎体积较小且透明，因此容易获得高质量的显微图片，但是，如何将上述方法进一步应用到哺乳动物胚胎仍是一巨大挑战一方面哺乳动物胚胎体积较大，需要在多个区域取景而获得完整胚胎图像其次，很多动物的胚胎不透明，需要利用特殊的胚胎处理方法来提高光的穿透性而获得高质量图像同时，哺乳动物胚胎的细胞数目巨大，后续的图像处理过程也是一个艰巨的任务毋庸置疑，活体成像技术的发展和应用，为胚胎发育的研究注入了活力，通过对模式生物的胚胎发育全过程的全景式精细的分析将为我们了解自身的发育过程提供重要参考监测体内生理生化与细胞行为除了分析胚胎的发育，活体成像技术还能应用于活动物体内这方面最早的尝试可追溯到1839年，鲁道夫·瓦格纳( Rudolph Wagner)用今天看来极为简单的明视场透视方法，记录了活青蛙蹼足的白细胞和血管壁的相互作用如今，运用更为高级的体内显微技术，研究人员能检测生物体的多种生理生化指标和细胞行为例如，测量大脑局部血流量和神经胶质细胞的功能，观测伤愈过程中血管形成，以及测量肝脏的耗氧量等体内成像技术还能实现实时观测活动物体内单个细胞的功能例如，研究神经环路的形成全过程，探测中枢神经系统的免疫细胞的行为变化，追踪树突细胞在体内的迁移和造血干细胞的行为，以及监视肿瘤细胞的侵润和转移过程等多种重要的病理学指标。

不难想象，这些研究成果将有广泛的应用前景如果医学工作者可以应用体内成像技术测量人体的组织和器官的功能，将为疾病的诊断和治疗提供巨大帮助实时观测基因表达调控和蛋白相互作用在活体状态下直接观测基因的活性是分子生物学家梦寐以求的技术传统研究基因功能的方法大多基于体外的生物化学实验，而活体成像结合基因分子标记技术可以直接观测基因和蛋白在每个细胞的表达、活性和功能研究人员通过将目标蛋白打上荧光标记，然后利用活体成像便可记录荧光蛋白的强弱，而对基因在特定细胞和发育阶段的活性进行实时追踪宾夕法尼亚大学的研究人员利用双色荧光活体成像技术实现了追踪多个基因在整个发育过程中，每一个细胞内的活性他们采用红色荧光蛋白RFP标记细胞、绿色荧光蛋白GFP标记目标基因、红绿叠加的黄色细胞便可指示基因在何种细胞有活性这项研究为系统分析基因调控在活体发育中的功能提供强有力的工具比如．斯隆凯特琳研究所的科研人员利用该方法标记和分析细胞特异性基因的活性，成功实现了自动化地分析胚胎细胞的发育命运，例如，如何调控哪些细胞将来会变成产生肌肉，或者表皮，或者神经组织蛋白常通过相互作用发挥功能，若能获知蛋白之间在活体状态下细胞内的相互作用，无疑将推动分子生物学发展。

科学家利用荧光能量共振转移(FRET)检测方法结合活体成像，成功实现了实时监测两个蛋白在何种细胞中发生了相互作用FRET的基本原理为，将两个待检测蛋白分别打上不同颜色的荧光标记，当蛋白发生相互作用时，两个荧光标记产生近距离的接触而诱发能量转移现象这样，荧光显微镜通过捕捉这一过程，而监测蛋白在活体内细胞中相互作用FRET并非全新的技术，但是它与活体成像的强强联手使得这项技术能用于体内活体细胞这正是活体成像技术的魅力所在，通过与多种研究方法结合而将触角深入至体内的单个细胞定量分析生物系统从定性走向定量是生物学研究的发展趋势活体成像技术和荧光标记方法的结合推动生物学走向定量荧光蛋白的光强度是可以通过对显微图片的分析而直接定量测量，因此，通过选择合适的标记方式和标记靶标，活体成像能实现对大量复杂的生物学过程的精细与实时定量，而使得生物学研究更为客观与科学例如，利用活体成像和图像分析技术，瑞典卡罗琳斯卡研究所的科学家实现了定量测量胚胎发育过程中每个细胞、每一分钟，在胚胎中的3D位置，及其随发育推移的动态改变他们利用这些数量信息构建了模型，用于分析胚胎形态建成中的细胞相互作用另外，研究人员通过定量测量胚胎细胞周期的长度与周期调控蛋白的定量变化，实现了定量分析细胞周期和细胞同步化分裂的调控机理。

利用活体成像，研究人员监测并定量分析了形态发生素的浓度梯度，并揭示了该梯度效应如何指导神经管形成过程中细胞的协调运动过程此外，通过标记细胞信号分子，细胞信号转导过程也能被定量分析，包括信号分子的浓度，受体蛋白的激活和循环，以及下游响应分子的动态变化等最近，来自法国遗传学和分子细胞生物学研究所的科学家，利用细胞膜荧光标记和定量分析技术定量分析了细胞的形态变化，并发现生物力学效应在表皮细胞形态发生过程中起到关键作用上面这些实例表明，活体成像技术极大地促进了定量生物学的发展与常规的显微定量技术不同，活体成像能实现定量测量整个生物体系随时间的活性变化，利于更加全面地洞悉生命现象，因此推动了生物研究从定点的静态测量发展到全景式的动态模拟的新阶段精细操纵活体特定细胞的功能活体成像技术与细胞操纵技术的结合还能实现对生物体单个细胞的精细操控尤其是近年来蓬勃发展的光遗传学方法可实现对活动物的特定细胞进行精细的操控光遗传学，顾名思义，就是通过光而对生命活动实现遗传操控基本原理为，首先通过遗传学的方法，在特定细胞中引入一受光调控的蛋白，然后通过将光导入特定细胞，而对存在光感蛋白的细胞行为实现操控运用光遗传学方法，科学家已经实现对哺乳动物活体特定细胞的操纵和功能测量，如分析特定神经细胞在学习和记忆过程中的行为和功能。

光遗传学技术近年来得到了学术界的广泛关注，并取得了长足的发展2010年，该项技术被《自然一方法学》杂志评为年度关注技术同时《科学》杂志也将光遗传学评为“十年突破”技术不难想象，活体成像和光遗传学的紧密结合使得控制和调节生物体的行为和功能不再是天方夜谭结束语光无痕，却点亮了生命；光无影，却指引着前方活体显微成像是一门借助光来窥探生命奥秘的艺术与科学随着显微技术和荧光标记手段的不断发展，活体成像也将能更清晰地投影生命活动，更犀利地看透生命本质作者简介杜茁，中国科学院遗传与发育生物学研究所，研究员责编 桑新华）  -全文完-。