丹参酮ⅱa对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制.doc

丹参酮II A对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及机制作者：李浩，刘开祥，俸军林，曾爱源，唐永刚【摘要】 目的探讨丹参酮HA (Tan IIA)对缺血再灌注损伤 大鼠保护作用及对额顶部皮质中性粒细胞浸润、自由基含量、能量代 谢的影响方法将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Tan IIA 低剂量治疗组和Tan IIA高剂量治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再 灌注模型Tan IIA高、低剂量治疗组于术前连续灌胃给药3 d, 1 次/d用生化法观察缺血90 min再灌注24 h大鼠额顶部皮质髓过氧 化物酶(MP0)活性、超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)含量、 三磷酸腺昔(ATP)含量及脑含水量变化，并进行2, 3, 5 一三苯基 氯化四氮哩(TTC)染色检测脑梗塞体积结果Tan IIA治疗组脑梗 塞体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有显著性 (P<；O. 05)；与缺血再灌注组比较，Tan HA治疗组显著降低MPO 活性、MDA含量，增加SOD、ATP含量，降低脑组织含水量，高、低 剂量组之间差异亦具有显著性(P<；O. 05)o结论Tan IIA对缺血再 灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与减轻缺血再灌注损伤炎症反 应，减轻氧化性损伤和改善能量代谢有关。

关键词】缺血再灌注；髓过氧化物酶；自由基；三磷酸腺昔;丹参酮IIAbstract ： ObjectiveTo study the effect of Tanshinone II A (Tan IT A) on neutrophils infiltration and the contents of free radical and ATP in ischemic frontal and parietal cortex of cerebral ischemia reperfusion (I/R) rats.Methodsln this experiment, rats were randomly divided into 4 groups, namely sham operated group, I/R group,low dose Tan IIA treated group and high dose Tan II A treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method. Rats were pretreated with Tan IT A ig for 3d,respectively. After 90min MCAO following 24h of reperfusion, the MPO activity, the contents of SOD and MDA in ischemic frontal and parietal cortex were investigated. TTC staining was used to calculate the cerebral infarct volume. ResultsCompared with I/R group,cerebral infarction volume in low dose Tan IT A treated group and high dose Tan IIA treated group decreased in a dose-dependent manner (all P<；0. 05). Compared with I/R group, low and high dose Tan II A treated groups dose-dependently reduced MPO activity,the content of MDA and brain water content, increased the activity of SOD and the content of ATP. ConclusionTan II A may aueviate cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the inflammation reaction , free radicals and the disbanlance of energy metabolism.Key words： Ischemia-reperfusion； Myeloperoxidase； Free radical； ATP； Tanshinone IIA丹参Salvia miltorrhiza Bge为唇形科多年生草本植物，是我国 传统具有活血化淤作用的中药，已被广泛用于心脑血管疾病的治疗， 但其作用机制尚不十分清楚。

丹参酮（Tanshinone）是丹参的有效活 性组分，其中丹参酮HA （Tanshinone TTA, Tan TTA）为丹参酮中 含量最高的活性成分本实验采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研 究丹参酮IIA对大鼠脑缺血再灌注损伤缺血区额顶部皮质中性粒细胞 浸润、自由基含量、能量代谢、脑组织含水量及梗塞体积变化的影响, 探讨其对脑再灌注损伤保护作用机制1材料与方法1. 1药品与试剂Tan HA由提供上海第一生化药业有限公司提供，纯度85% 髓过氧化物酶（MP0）,丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）试剂 盒均购于南京建成生物工程研究所TTC购自中国医药集团上海化学试剂公司1.2动物分组及给药方法健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共100只，质量（25030） g （广西医科大学动物实验中心提供）按随机分组原则分成假手术组 （25只）、缺血再灌注组（25只）、Tan HA低剂量治疗组（25只） 及Tan IIA高剂量治疗组（25只）Tan低剂量治疗组（15 mg/kg） 和高剂量治疗组（30 mg/kg）均于术前连续灌胃给药3 d, 1次/d, 假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水灌胃。

第3天给药后1 h建立缺血90 min再灌注24h动物模型1.3动物模型的建立参照Longa等［1］的方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型 采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞线栓采 用石蜡线栓线栓直径约0. 27 mm,插入深度约18 mm,此时线栓头 位于大脑中动脉起始部缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注神 经功能缺陷评分：按照Longa等［1］评分标准，各组分别在再灌注 24 h进行评分0分：正常，无神经学征象；1分：动物不能完全神 展右前肢；2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾 现象；3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚；4 分：无自发活动，有意识障碍神经功能缺陷评分在1〜3分为模型 成功1.4 MPO活性的测定再灌注24h,将大鼠开颅取脑，置于42冰箱5 min,在冰浴 下取左侧距离嗅球尖端7~11 mm之间的额顶部皮质，以试剂盒提供 的匀浆介质制成脑组织匀浆严格按试剂盒说明书步骤要求操作，计 算出MPO活力单位1. 5 MDA和SOD的测定再灌注24h,将大鼠开颅取脑，置于4C冰箱5 min,在冰浴 下取左侧距离嗅球尖端7~11 mm之间的额顶部皮质，以试剂盒提供 的匀浆介质制成脑组织匀浆（步骤和方法同上）。

严格按试剂盒说明 书步骤要求操作，计算出MDA和SOD含量1.6三磷酸腺昔（ATP）含量测定再灌注24 h,将大鼠开颅取脑，置于4C冰箱5 min,在冰浴 下取左侧距离嗅球尖端7〜11 mm之间的额顶部皮质，迅速加入乙精, 混匀，冰浴离心脱蛋白，离心后取上清液水系滤膜过滤后，-86C保存用高效液相测定ATP含量1. 7脑含水量检测再灌注24 h,各组随机取5只大鼠，断头取脑后，快速称取 左右大脑半球湿重，置110〜1151烤箱内烤至恒重，再分别称其干 重，用（湿重-干重）/湿重的百分比，作为衡量脑含水量指标1.8 TTC染色再灌注24h,将各组另外5只大鼠深麻后开颅取脑将鼠脑置 于一4笆冰箱20min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2%TTC溶 液中，水浴、多聚甲醛液固定用计算机病理图像分析仪及梯形法计 算出梗塞灶体积，各脑片梗死灶体积之和即为梗塞体积左侧大脑半 球梗死灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色 部分组织表现为由白色向红色过度区1. 9统计学方法数据处理采用SPSS11. 5统计软件进行运算，结果以s表示,组间差异显著性检验采用方差分析2结果2. 1 TAN IIA对MPO活性的影响结果见表1。

假手术组MPO活性呈低水平缺血再灌注组缺血 侧MPO活性较假手术组明显升高（P<；O. 05）； TAN IIA高、低剂量 治疗组MPO活性较缺血再灌注组明显降低（均P<；O. 05）；高、低 剂量组之间差异亦具有显著性（P<；O. 05）o表1 TAN IIA对MPO, MDA, SOD, ATP含量，脑含水量及脑梗塞体积影响（略）2.2 Tan IIA对MDA、SOD含量的影响缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质SOD含量下降,MDA含量升高, 与假手术组比较，差异具有显著性（P<；0.05）Tan IIA治疗组可 提高额顶部皮质SOD含量，降低MDA含量，与缺血再灌注组相比较， 差异具有显著性（P<；0.05）；高、低剂量组之间差异亦具有显著性 （P<；O. 05）o 见表 lo2.3 Tan IIA对ATP含量的影响缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质ATP含量下降，与假手术组比 较，差异具有显著性（P<O. 05）； Tan IIA治疗组ATP含量升高， 与缺血再灌注组相比较，差异具有显著性(P<；O. 05),高、低剂量 组之间差异亦具有显著性(P<；0. 05)o见表1。

2. 4 Tan IIA对脑水肿的影响缺血再灌注组缺血侧脑组织含水量较假手术组明显升高，差异 具有显著性(P<；0. 05)； Tan IIA治疗组降低脑组织含水量，与 缺血再灌注组相比差异有显著性(P<；0. 05),高、低剂量组之间差 异亦具有显著性(P<；0. 05)o见表12.5 Tan IIA对脑梗塞体积的影响TTC染色后，缺血再灌注24h左侧大脑半球梗塞灶区呈白色， 主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色部分组织表现为由白 色向红色过度区TTC染色形态学观察显示，用石蜡线栓法制备大鼠 局灶性脑缺血再灌注模型，可使大脑中动脉供血区出现恒定的、复制 性良好的梗塞灶(图1)Tan IIA高、低剂量组梗死体积较缺血再 灌注组显著减小(P<；0. 05)；高、低剂量组之间差异亦具有显著性 (P<；0. 05)o3讨论何丽娜等［2］研究发现，丹参酮对原代大鼠神经细胞缺血性损伤 有保护作用本研究结果也证实，脑缺血再灌注损伤给予Tan IIA治 疗，可明显减少减轻再灌注损伤脑水肿及梗塞体积，对缺血脑组织有 保护作用，高剂量GBE的保护效果更显著MPO主要存在于中性粒细胞的噬天青颗粒中。

MPO活性反映中 性粒细胞在脑组织中浸润程度我们前期研究已证实，脑缺血再灌注 损伤出现了中性粒细胞参与为标志的炎症反应过程，减轻脑缺血再灌 注损伤后炎症反应对缺血脑组织有保护作用L3］o本研究结果提示， 脑缺血再灌注损伤给予Tan IIA腹腔注射治疗，可明显减少缺血再灌 注后MPO活性，减少中性粒细胞的浸润，对缺血再灌注损伤炎症反应 有抑制作用胡霞敏等：4］预防性用药给予缺血再灌注损伤大鼠Tan IIA治疗，发现Tan IIA。