腺病毒操作手册.pdf

Shanghai GeneChem Co. Ltd 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 邮编： 201203 ： 86-21-51320189 ： 86-21-51320179 网址： Email： service@ Page 1 of 4 重组腺病毒操作手册 (Version 2.0) 上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月 Shanghai GeneChem Co. Ltd 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 邮编： 201203 ： 86-21-51320189 ： 86-21-51320179 网址： Email： service@ Page 2 of 4 重组腺病毒实验系统 腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒，它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体构成 Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。

重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段，感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞 TCA8113 SGC-7901 NRK PC-3 Huh-7 Glia Rabbit Mesenchymal Stem Cells Human Mesenchymal Stem Cell Rat Cardiac Fibroblasts Shanghai GeneChem Co. Ltd 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 邮编： 201203 ： 86-21-51320189 ： 86-21-51320179 网址： Email： service@ Page 3 of 4 重组腺病毒操作过程 一 , 注意事项 : 1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜如果使用普通超净工作台操作病毒，请在打开含有病毒的容器盖子前关闭超净台的排风机尽快操作，尽量缩短开盖后的病毒在关闭了排风机的超净台中停留的时间关闭所有含有病毒的相应容器盖子后，再打开超净台排风机 2. 操作病毒时请穿实验服，带口罩和手套 3. 操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70%乙醇加 1%的 SDS 溶液擦拭干净接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于 84 消毒液或 1%SDS 中浸泡过夜后弃去 4. 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板用 70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照离开显微镜实验台之前，用 70%乙醇清理显微镜实验台 5. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用 parafilm 膜封口后离心，而且尽量使用组织或细胞培养室内的离心机 6. 脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手 二 , 重组腺病毒颗粒的储存与稀释 1. 收到病毒液后，如需长期保存则分装后存放于 -80℃避免反复冻融，否则会降低病毒滴度正常保存条件下，病毒可以存放于 -80℃稳定保存 6～ 12 个月如存放超过 12 个月，需要重新检测病毒滴度 2. 吉凯基因提供的重组腺病毒颗粒溶于 Enhanced Infection Solution 中使用病毒时，请将病毒从 -80℃冰箱取出，冰浴融化 三 , 目的细胞感染预实验 在正式实验前，需要进行腺病毒感染目的细胞的预实验，该实验的目的：第一，检测腺病毒是否能够感染目的细胞；第二，腺病毒感染目的细胞的最佳条件。

通常使用带有 GFP标记的腺病毒具体实验步骤如下： 1. 实验前一天分别接种 5×103个目的细胞于 96 孔培养板中（至少接种 8 个孔的细胞） ，所加培养基体积为 100 µl 不同种类的细胞生长速度有所差异， 为保证有较好的实验结果，进行病毒感染时细胞的融合率约为 40～ 50% 2. 准备 6 个无菌的 Ep 管，在第一个 Ep 管中加入 990 µl 的完全培养液，其余的 5 个管子中各加入 900 µl 的完全培养液 Shanghai GeneChem Co. Ltd 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 邮编： 201203 ： 86-21-51320189 ： 86-21-51320179 网址： Email： service@ Page 4 of 4 3. 取 10 µl 腺病毒原液加入 990 µl 的 Ep 管中做 1:100 稀释（ 10-2） ；然后以此为起点，再取 100 µl 稀释液加入到 900 µl 的 Ep 管中做 1:10 稀释 (10-3)，直至稀释到 10-7 4. 从孵箱中取出 96 孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。

吸弃旧培养液，然后依次将 10-3至 10-7稀释的病毒液加入 96 孔板中，每种稀释度的病毒取 100 µl 加入到 96孔板中，未加入病毒的细胞孔中加入同样量的完全培养基作为对照组 5. 8-12 小时以后请观察细胞状态如果细胞状态与未感染组无明显差异，表明该病毒对细胞没有明显毒性作用，请不要换液，继续培养 6. 由于腺病毒感染细胞速度快，分别在感染后 12、 24、 48 小时观察细胞中荧光表达情况根据细胞的生长状况、荧光表达情况综合判断病毒在哪个稀释度下作用效果最好，并以此稀释度下的病毒浓度作为后继实验的依据 四 , 常见问题 1. 如何确定我所用的目的细胞是否可以被腺病毒感染？ 腺病毒有广泛的宿主范围 ,它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞只有少数细胞系不被感染，例如一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性为了确认所使用的目的细胞是否能够被腺病毒感染，需要通过带有标记（如GFP）的腺病毒对目的细胞进行预实验，预实验的步骤参考 “目的细胞感染预实验 ” 2. 腺病毒载体在体外 (in vitro)实验中应注意哪些问题？ 由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同，可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。

病毒感染细胞的最佳时期是细胞处于对数生长期时， 因此，在细胞消化后 12～ 24 小时加入病毒病毒感染时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准一般感染腺病毒 24 小时后就能检测到目的基因的表达， 48 小时表达达到较高水平 3. 如何确定感染细胞时腺病毒的最佳浓度？ 最佳的实验结果需要最佳的腺病毒用量，用量少则达不到 100%的感染效率，用量多可能会对细胞有毒害作用或其他不可预测的效应为了确定目的细胞的最适病毒用量，需要在正式实验开始前， 建议先完成 “目的细胞感染预实验 ”， 以此获得的数据作为正式实验的依据。