蔗糖酶米氏常数的.ppt

蔗糖酶米氏常数的测定 【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系， 学习求蔗糖酶米氏常数的方法 【原理】：米氏方程式 v = Vmax[S] Km +[S]式中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏 常数米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaVer— Burk的作图法(双倒数作图法) 将米氏方程式改写为下列倒数形式： 1／V=Km／Vmax·1／[S]+1／Vmax实验时，选择不同的[s]，测定相应的v，求出两者 的倒数，以1/[s]为横坐标，以1/υ吉为纵坐标作图 ，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为- 1/Km 【仪器与试剂】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒 表、坐标纸 2．试剂 标准葡萄糖溶液（1mg/ml）、 0.2 mol／L蔗糖溶液、 0.2 mol／L NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 ０.1mol／L NaOH溶液 3，5一二硝基水杨酸试剂 【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定管号012345 葡萄糖标准液/ml 00.20.40.60.81.0相当葡萄糖量/mg 00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.03,5—二硝基水杨酸 试剂 /ml3.03.03.03.03.03.0将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25ml，摇匀。

测540nm处 A值以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标 准曲线取试管8支，按1～8编号,按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分 别加入8支试管中，于37℃水浴中保温10min 取一定量酶液，放入同一水浴中保温约10min 于各管中依次按同样时间间隔(0.5min或1min)加人已保温过 的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37℃水浴中作用5min 按同样次序和时间间隔，加入5mL 1mol／L NaOH，摇匀， 终止反应 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂 和1.0mL水的试管中，都放入沸水浴中加热5min，冷却后稀 释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标， 1/v为纵坐标作图，由图求出Km值2．底物浓度和初速度υ测定反应物活力测定数据处理管 号0.2mol ／L 蔗糖 液 (ml)醋酸 缓 冲液 (ml)酶液(ml)1mol／L NaOH (ml_)吸取 反 应物 (ml)水杨 酸 试 剂 (ml)水 (ml)A540 υ底物 浓 度1/[s] (1/M)1/υ1 2 3 4 5 6 7 80 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.75 5.05.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 1.25 01.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.05.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.01.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.03.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.01.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0【实验结果与讨论】 。