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实验一实验二实验三哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳（定量）反转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）DNA的琼脂糖凝胶电泳实验一哺乳动物细胞总RNA勺提取、电泳一、实验目的学习并掌握总RNA的分离提取，检测质量以及定量的方法二、实验原理细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNAi成，其中rRNA含量最多（占80%-85%）在pH60微酸环境下，RNA相对稳定,碱性环境下，易分解RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA舌性,是实验成败的关键RNA的产量取决于组织或细胞的来源，但是,通常每毫克组织可获得4〜7口gRNA,每106细胞可获得5〜10口gRNA提取的RNAA60/A280比值一般为1.8〜2.0.在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜,保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase;2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯;3）空气中灰尘和细菌含RNase应建立干净的操作环境;实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNATRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解.（注意：TRIzol具有强烈腐蚀作用，小心操作。

三、实验材料、试剂与器材1、细胞（5x106Hela）2、DEPC水溶液，PBSTAE3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯4、TRIzol试剂购自Invitrogen5、烧杯（1000，500，100,50ml若干），量筒（1000,500,250，50，20ml若干），玻璃棒,药勺,试剂瓶，三角瓶枪头（1000、200、20ul），离心管（02ml、0.5mlPCR管，1.5ml、2ml、7ml离心管）,枪头盒四、实验步骤RNA提取前的准备1）、玻璃器皿，金属及耐250C物品的处理：于高温烘箱中干烤，180C，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部2）、塑料制品的处理：005-01%的DEPC（焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、02ml、05mlPCRt，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好121C,30分钟高压灭菌,以消除残存的DEPC否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。

DEPC是蛋白质强变性齐U,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性具强挥发性，致癌物，因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作3）、试剂的配制：试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌，但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌所需烧杯等必须干烤处理以后方可用0.05-01%o的DEPC水（三蒸水）,磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜,121C，30分钟高压灭菌RNA的提取（TRIzol法）:安全去除细胞生长介质往细胞培养瓶中加入1mlPBS洗涤单层细胞，不要将细胞破裂，倒出PBS洗涤液分入2个15mlEP管中向细胞培养瓶中加入2mlTRIzol，以枪小心吹打室温下培育五分钟（使核蛋白复合物充分分离）时间可能更长30min向EP管中加入0.2ml氯仿/1mlTRIzol,用力摇晃15秒钟，室温培育三分钟12000g,4°C离心15min小心吸取上层无色水样层（06ml/mlTRIzol）转移至一新EP管中加入05ml/mlTRIzol异丙醇，室温放置15min12000g,4°C离心10min，轻轻倒去上清*加入1ml/mITRIzol75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min,4°C离心5min弃上清，倒置EP管,5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水55C加热RNA—10min（提高RNA溶解度），一70C保存注意：异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。

因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离岀，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要3、紫外分光光度法检测RNA浓度3、琼脂糖凝胶电泳检测（或RNA定量仪器）1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；2）、以DEPC处理的水稀释50xTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1xTAE备用；3）、用以上1xTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；4）、电泳5V/cm电泳20min5）、电泳图谱：28s和18s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上实验二反转录一聚合酶链式反应（RT—PCR）一、实验目的通过本实验掌握RT-PCF工作原理及操作方法二、实验原理逆转录一聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT—PCR是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：即RT（将mRNA反转录成cDNA和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）其原理是：由总RNA或poly（A）+RNA（mRNA）采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCF扩增，而获得目的基因或检测基因•（一）、反转录酶的选择：3. Money鼠白血病病毒（MMLV反转录酶：有强的聚合酶活性，RNABH活性相对较弱；2.禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNABH活性；Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2■存在下，允许高温反转录RNA以消除RNA模板的二级结构；MMLX反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScript□。

此种酶较其它酶能多将更大部（完整版）汇总一一RT-PCR羊细步骤分的RNA转换成cDNA这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA.（二）、合成cDNA引物的选择：1随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA;Oligo（dT）:是一种对mRNA特异的方法因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly（A+）尾，此引物与其配对，仅mRN刚被转录由于Poly（A+）RNA仅占总RNA的1—4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小；3•特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3端最靠近的配对引物起始用此类引物仅产生所需要的cDNA导致更为特异的PCR扩增.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要,必须完整，且不被基因组DNA亏染三、实验材料、试剂与器材第一链cDNA合成试剂盒（promega公司）dNTPmix:含dATRdCTRdGTPdTTP各2mM（申能博彩）TaqDNA聚合酶（Takara）特异引物（Invitrogen合成）模板RNA（上次实验提得）四、实验步骤cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一现以promega公司提供的M—MLV试剂盒为例•（1）在pcr管中，加入0.5口linhibitor（40U/口l），加入总RNA0.5-2口g,在管中加10口MOligo（dT）12—182口l,补充适量的DEPCHO使总体积达14口l（＜15口l），轻轻混匀、离心；（2）70C加热5min,立即将微量离心管插入冰浴中，冰浴5min,离心，将液体收至管底，冰浴中加入下列试剂的混合物：10mMdNTPmix1.5口15XPCRbuffer5口linhibitor（40U/口l）1口lM—MLV反转录酶1口1DEPC水2.5口ITotal25(1142C孵育60min。

于94°C加热3min以终止反应(4)-20C保存备用(第一链反应混合物可在-20C保存3个月以上)1. PCR(1)取PCRt,依次加入下列试剂：5口10.5口12口12口11口110XPCRbufferMgcL2口1dNTP(10mM上游引物(10pM下游引物(10pM)第一链cDNATaq酶(1u/口l)1口lddH2O115口ITotal25口1(2) 轻轻混匀，离心；(3) 设定PCR程序.在适当的温度参数下扩增28—32个循环.条件：194C5min294C40sec360C40sec472C15sec5GoTo2,32cycles104CForever(4) 电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；2. 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描，检测相对表达量•五、注意事项•逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解；•为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量，防止假阴性，常用的内参有G3PD甘油醛-3-磷酸脱氢酶)卩一Actin(卩一肌动蛋白)等；防止DNA的污染：(1)可采用DNA酶处理RNA样品。

2)在可能的情况下，将PCF引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA勺共线性实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳、实验目的（完整版）汇总一一RT-PCR羊细步骤学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA勺原理和方法，检测质粒DNA勺纯度、浓度与分子量二、实验原理琼脂糖（agarose）是一种直链多糖，是由D-半乳糖和3,6—脱水一L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联,因此与琼脂一样能形成凝胶.琼脂糖带有亲水性,不含有带电荷的基团,不引起DNA变性，不吸附被分离的物质，是一种很好的凝胶剂.45C开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小决定于琼脂糖浓度DNA分子碱性环境下带负电荷，外加电场作用下，从负极向正极移动，兼具电荷效应与分子筛效应•不同DNA,其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，以分出不同区带•1. EB（溴化乙锭）为扁平状分子，与DNA分子形成EB-DNA复合物，在UV照射下，发射荧光，且荧光强度与DNA质量成正比，以肉眼观察，可检测5ng以上的DNA.（注意：EB分子具有强致癌性，请小心使用三、实验材料、试剂与器材质粒DNA微波炉、电泳仪、微型电泳槽、天能凝胶成像系统、三角瓶（250ml）琼脂糖、50xTAE6xlodingbuffer、EB母液（0。

5mg/ml）四、实验步骤（一）制胶选择大小合适的电泳制胶板，选择孔径大小适宜的。