马克斯克鲁维发酵饮料的研制.docx

马克斯克鲁维发酵饮料的研制 论文导读：我们应用kefir的重要菌相马克斯克鲁维酵母菌，在我们自己设计的培养基质和环境条件下，进行了纯菌种的培养发酵，获得了一种马克斯克鲁维纯培养发酵基料关键词：马克斯克鲁维酵母，培养基质，生物发酵，绿色有机饮品近年来，随着人们生活水平和保健意识的不断提高，饮品业在世界范围内正发生着一场深刻的变革世界各国人民不断屏弃那种使用各种添加剂，如色素、香精等对人体无益、不安全的成分进行勾兑的传统做法，代之追求以天然食品或野生植物为原料榨汁或通过微生物有益菌的发酵勾兑，开发出集天然、营养、保健于一[1]体的新型绿色健康饮品为时尚Kefir作为一种著名的传统发酵饮品，千百年来以其独特的营养和保健作用而受惠于世界各国人民，并在世界范围内日益受到消费者的青睐[1]研究资料显示：在kefir的培养发酵代谢产物中，存在着多种能够维持人体健康和促进人体生长发育的营养及活性因子，并且含有能够抑制和杀灭某些对人体有害的病原微生物的作用，因而被许多国家和地方用于生活保健，甚至临床治疗某些重要疾病[2]但是在世界各国各地区的kefir的制作中，由于生产商所使用的发酵剂和生产工艺的不同，因而导致了kefir最终产品的口感和质量存在着很大的差异。

为了克服这些不足，世界各国的学者正在不断地探索，试图应用kefir中的不同菌相、培养发酵基质和不同生产工艺，开发出不同于传统kefir的新品种[3]马克斯克鲁维酵母是kefir中的重要菌相，根据我们的研究与大量报导分析，它很可能是kefir中的主要酵母菌相或决定菌相[4]长期以来，世界许多学者对马克斯克鲁维的纯培养发酵物进行了大量的研究报道业已证明：在马克斯克鲁维培养代谢产物中同样存在着多种有益于人体健康的重要活性物质这为应用马克斯克鲁维酵母开发新型饮品奠定了坚实的理论基础，因此引起世界上kefir研究者的极大关注2003年，希腊学者[5]Y.Kourkoutas等利用乳清作为原料，通过马克斯克鲁维的高温发酵,研制生产出一种低酒精度的新型饮料研究认为：这种饮料是一种具有独特芳香潜力的优质饮品为了探索和研制出一种符合东方人饮食习惯的新型马克斯克鲁维纯培养发酵饮品，我们应用一株从kefir中分离的马克斯克鲁维酵母菌（经中国科学院微生物研究所采用培养形态和DNA序列分析认定），在我们自己设计的培养基质上通过传统和现代工艺发酵，获得了一种富含多种营养成分和健康活性物质的绿色有机发酵基料应用这种发酵基料的300倍浓缩液，以West大鼠和昆明小鼠为实验对象进行了食品卫生安全毒理学检验，结果证明该基料属无毒级。

我们将这一基料通过一系列后续处理和勾兑调制，将其研制成一种目前未见市场流行的饮料新品种它集营养、健康、天然于一体，是一种新型的绿色有机发酵饮料1.材料和方法：1.1菌种的分离培养在无菌、室温条件下，将来自民间的“藏灵菇”（kefir粒）经灭菌PBS洗涤三次，铂耳圈勾取其深层菌落，接种于分离培养基上（培养基配方为：马铃薯汤20%，葡萄糖2%，麦芽糖1%，乳糖0.5%，蛋白胨0.5%，琼脂1.6%），置35℃恒温培养箱中，经5-7天培养；选生长良好（肉眼观察，菌落奶酪状，乳白色或深褐色，表面平滑，有光泽，边缘光滑，显微镜观察为大量的菌丝和孢子细胞）的单独菌落无菌条件下做二次分离（所用培养基同前）后，置35℃恒温培养箱中培养3-5天，选生长良好（肉眼与显微镜观察同前）的单独菌落，无菌条件下接种于保存培养基上，灭菌石蜡油封闭， 4℃下保藏备用1.2发酵菌种液的制备1.2.1Ⅰ级发酵菌种液：将保存于4℃条件下的菌种，无菌条件下接种于菌种液培养基（培养基配方为：葡萄糖2%，麦芽糖1%，乳糖0.5%，蛋白胨0.5%，加水至100毫升）试管中，30℃恒温条件下培养2-3天；将试管菌种液无均条件下接种到场250毫升瓶装的菌种液培养基中（配方同前），30℃恒温条件下培养2-3天。

1.2.2Ⅱ级发酵菌种液：将一级发酵培养液，无菌条件下接种于250ML瓶装的培养液中，在30℃恒温条件下培养2-3天，（其培养剂配方同Ⅰ）1.3发酵基料的制备：将Ⅱ级菌种液，无菌条件下接种于发酵瓶（罐）培养液中，25-35℃条件下，静置发酵三天，然后在20℃的条件下静置后发酵三天1.4成分检测：1.4.1营养及活性成分检测：将上述方法制备的发酵基料，应用下列各种方法进行检测，以获得相应数据：蛋白质用凯氏定氮法；脂肪用灰烬法；还原糖用滴定法；微量元素用原子吸收法（A.A.S）测定（仪器：中国北京产WFX-ID型原子吸收仪）；维生素用原子发射光谱分析法（A.E.S）测定（仪器：美国Thermo Electron公司产WP-I型）；氨基酸用氨基酸分析仪（A. A. A ）测定（仪器：日本HITACHI公司生产，spectro fluorophotometer shimadzu RF-5000型）；SOD用黄嘌呤氧化没法-NBT还原法测定（仪器：美国产Variam HPLC-5000）；低聚糖、脂肪酸、黄酮类化合物用高效液相色谱法测定（HPLC）测定（仪器：美国varian HPLC-5000）。

1.4.2毒理学检测：用上述基料的300倍浓缩液（将发酵基料混匀，经JY99-2D型超声波破碎机作用10min3次，浓缩后分装250毫升瓶115℃处理10分钟，使用前用PBS液1：1稀释，成分检测，有效成分含量为其原液的300倍），以wistar大鼠和昆明小鼠为实验对象，进行了小鼠急性毒性实验、大鼠急性毒性实验、小鼠骨髓微核实验、小鼠精子畸形实验、致畸实验和３０天喂养实验1.5.1降血糖试验：应用上述基料的细胞破碎混合液（将发酵基料混匀，经JY99-2D型超声波破碎机作用10min3次）、原液（将发酵基料经滤布过滤的滤过液）、原液的50%稀释液（原液与水1：1稀释），依照《保健食品检验与评价技术规范》之《辅助降血糖方法》（中华人民共和国，2003年版），对四氧嘧啶尾静脉注射造模的昆明种小鼠进行试验选取其血糖值高于10mmol/l的高血糖小鼠分成模型对照组、细胞破碎混合液组、原液组、50%稀释液组、药物降糖组，共5组，每组12只动物其中模型对照组给与日常饮水，其余分别给与发酵基料的细胞混合液、原液、50%稀释液和12倍人标准用量的降糖药液，每日20ml光照条件下常规喂养、连续30天检测其血糖值、比较各组动物血糖值及血糖下降百分率）。

1.5.2抗脂肪沉着试验：应用上述三个浓度发酵基料为实验材料，依照《中华人民共和国真菌类保健食品评审规定》中《减肥功能检验方法》，将Wister大鼠随机分为空白对照组、模型对照组及三个受试样品组（发酵液细胞破碎混合液组，原液组，50%稀释组）自试验开始，实验组每组动物给予等量相应的受试样品，空白对照组和模型对照组饮以普通自来水除空白对照组外，其余各组都饲以高能量饲料试验45天后，剖腹取体脂（睾丸及肾周脂肪垫）并称重，测量统计实验期间的摄食量、食物利用率（食物利用率=增重/摄食量100%）体重增长、体脂值、计算体脂比以模型组为对照，对各实验组数据进行t检验，比较三组减脂效果1.6均质、脱气、调配：将上述方法制备的马克斯克鲁维发酵基料在均质机压力为30-35mpa的条件下，均质处理10分钟，再在50℃左右，真空度为0.5mpa的条件下脱气30分钟，然后按营养成分检测结果和产品设计指标进行勾兑和调味1.7过滤、灌装1.8检验、包装、入库2.结果与分析2.1工艺流程：2．2营养成分分析：见下表营养物质维生素矿物质有机酸活性物质蛋白质 0.2%VA8.4IU/ml铁4.66mg/kg2-甲基丙酸+多糖+脂肪 0.044%VD1.4IU/ml钙6.66 mg/kg甲基丙醇二酸+总黄酮+总氨基酸 0.02g%VE5μg/ml锌2.74 mg/kg正十八烷酸+亚油酸+还原糖 6.67%VB11.9μg/100ml镁31.32 mg/kg正十四烷酸+亚麻酸+低聚果糖 0.77%VB22.5μg/100ml硒0.08 mg/kg正己酸+花生四烯酸+低聚乳糖 0.81%VC1.30μg/100ml正辛酸+二十二碳五烯酸+低聚麦芽糖 0.91%正葵酸+2．3发酵基料的卫生毒理学检验分析：2．3．1.小鼠急性毒性试验：送检样品小鼠经口急性毒性试验结果ＬＤ５０大于10.5g/kgＢＷ，属无毒级。

2．3．2.大鼠急性毒性试验：送检样品大鼠经口急性毒性试验结果ＬＤ５０大于10.5g/kgＢＷ，属无毒级2．3．3.Ames试验：用平板掺入法，送检样品剂量达到5000μg/皿，加或不加S-9混合液对标准测试菌TA97、TA98、TA100、TA102试验结果为阴性2．3．4.小鼠骨髓微核试验：送检样品剂量达到10.0g/kgBW小鼠骨髓微核试验结果为阴性2．3．5.小鼠精子畸形试验：送检样品剂量达到10.0小鼠精子畸形试验结果为阴性2．3．6.30天喂养试验：送检样品剂量达8.3g/kgBW（相当于人体可能摄入量的300倍），经30天喂养，动物的一般形态（外观形态、活动、大便性状等）、摄食、生长状况良好；各项血液指标、血清生化指标、重要器官脏/体比值与对照组比较，经统计学处理差异无显著性意义（P＞0.05），各主要脏器病理组织学检查均未见异常改变2．4发酵饮料的食品卫生毒力学检验检验项目单位检验标准单项结果单项判定铜mg/kg/0.166/铅mg/kg/0.03/砷mg/kg/<0.2/菌落总数cuf/ml/<10/大肠杆菌MPN/100ml/阴性/致病菌/不得检出未检出符合2．5降血糖试验组 别剂量(ml/只/天）动物个数（只）给样前血糖（mmol/L）给样后血糖（mmol/L）降糖值（mmol/L）血糖下降率(%)阳性对照组20917.216.90.0130.78药物降糖组20913.785.987.856.6010倍浓缩组201216.467.449.0254.79原液组20915.608.537.0645.2950%稀释组20814.839.565.2635.472.6抗脂肪沉着试验组别摄食量食物利用率（%）增重（g）体脂值（g）体脂比%空白对照组537.8420.38109.64.381.8模型对照组589.2621.04124.05.22.0混合细胞破碎组545.7919.50106.83.371.4原液组561.7619.42109.13.821.650%稀释组605.2419.38117.34.21.72.7讨论2.7.1世界上众多kefir的研究者都普遍认为：kefir的特有品质和功效作用是由于它所含有的各种微生物菌相共生结果所形成的。

但不同菌相在kefir中所起的独特作用及其所产生的物质对kefir品质的影响究竟如何？至今未见有一致认识我们应用kefir的重要菌相马克斯克鲁维酵母菌，在我们自己设计的培养基质和环境条件下，进行了纯菌种的培养发酵，获得了一种马克斯克鲁维纯培养发酵基料通过我们对该基料有效成分的检测，结果发现，。