转化绿色荧光大肠杆菌.doc

转化绿色荧光大肠杆菌流程图:■ 用转比大厕杆茵扩■ 増质粒- 从大肠杆菌中提取PET28— 删并翻純化目的車因的PC R扩増胶回收所福酶切产物片段DNA的限制性內切關叫班DNAflg连接重组■頁组DNA的转化*pET-28a-EGFP 的表达L■荧光显微視检测二•实验设计原理:a）质粒分析:Ch 1(4117)HruEC"：'57 Il3?72|AjaH kSEJJi 才 \E5iS Il lSJTi敝盟初仃帕d卜厂、Sap toflKft』--t_KU kM$）叭LTth ill I申他严加回Sil ,Bfli UpMlI |T^-8flrAi|Wflxho in i* INvUHte fig ldl*> Hirwl 卅<73| w him Sic l门静 Eton iiim £kimH站斛| Mhti l|31T| AM« Ii21« Nfta I|2MrHunt：'bXp^i i^taiHMlH HlW)rEs-R..■ M

pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱注意： 载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以 T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来质粒的 F1复制子是被定向的，所以在 T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被 T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译 : : <石耳创!： n ia'j ： w £科 盛 叩I：- A act r^^ircn.ttfiTcr batacch r甘.加乂『瞄 砂 门用刿工 而而■>*IR乂？. 脚IK ftol \ hMrril：ll £nAl 臥 31 talT^一^乔1 XlfadHI JfcjrllHcbiticwh M*f>ftjfHli4iiulnf>l« Cloning Bm |m匚Q E p反口僕尸■富i jJfi岭uimmIi心冶穴『136*1；1 mr wtMir■苟ll&z■h*' E5FF vop coaon The 科対 J 静琴（"H f亡存泉曰Rd n1h-e DMA Drovil^H 呷 GLONTEGH W 戸j -订寸i to c^r hit 曲力”W * 电吨yme . y&u A ll Fl蛇0 Id -ran 如叭-M wcior inic s 腕肘 * “诞 丁逼韩PEGFP-N3为真核质粒，带有 kan抗性基因，目标基因为 EGFP蛋白基因。

选择酶切位点时，两个位点之间需包含该蛋白基因，不可切断根据需要，在多克隆位点中可选择 EcoR I ―― Xho I, EcoRI ―― Xba I等酶切位点，同时为了简化实验步骤，选择两种酶的 buffer相适宜的酶：Not I --BamH I b） DH5 a:大肠杆菌DH5z是一种诱变菌株，主要表现对外源 DNA的免疫缺乏是用于基因工程的菌种，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制 DH5a复制稳定c） BL21是蛋白酶缺陷株，表达出来的蛋白不会被降解，适合做蛋白表达 BL21生长要比DH5a快，这是他们的又一区别，在高密度发酵 BL21表达蛋白时，需要控制 它的表达条件，使得高密度且高表达d） 为了达到最佳的效果，我们的方案是先在 DH5a上构建质粒载体然后转入 BL21中表达三.实验材料a） 实验器材i. 自动PCR仪ii. 震荡台iii. 离心机iv. 4摄氏度冷藏柜b） 实验材料i. pET28aii. pEGFP-N3 质粒iii. 限制核酸内切酶1. Not I --BamH I2. 双酶切体系，buffer选择酶试剂盒配套或使用通用缓冲液iv. 大肠杆菌DH5av.大肠杆菌BL21vi.冰水vii.恒温水浴锅viii.缓冲体系等四•实验步骤a） 制备大肠杆菌DH5 a感受态细胞。

i. 挑取DH5 a E.coil单菌落接种至2mlSOC培养液，37C摇床过夜ii. 挑取0.5— 1ml过夜培养的菌液转种到 50ml SOB中，18C剧烈震荡，直至A600 达到0.6，取出水浴10miniii. 4C 4000rpm/min 10min.同时冰浴配置 TB溶液iv. 弃上清，倒置离心管于滤纸上v. 1mlTB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB溶液冰浴10-15min4C 4000rpm/min 10mi nvi. 去上清，沉淀重悬于 4mlTB中，冰浴10minvii. 加入280uL DMSO，混合均匀，冰浴 10minviii. 分装于EP管中，-80C或液氮保存ix. 检测感受态细胞的质量（阴性对照）X. 重复该过程，制备 BL21感受态细胞b） 质粒扩增i. 取100ul感受态细胞于冰浴上融化ii. 加入1ul pet28质粒和1ul PEGFP-N3质粒，轻轻吹匀，冰浴 30miniii. 将菌液放入42°C水浴热激90s，立即放入冰浴中 2miniv. 将菌液2000rmp/min 离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布于含卡那抗性的琼脂平板，平板于 37°C倒置培养过夜。

V. 同时进行阳性和阴性对照vi. 将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌落vii. 将移液枪尖打入5ml培养基内，放入37°C摇床中rpm/min,摇菌16小时左右viii. 运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提ix. Goldview 染色用浓度为 1%的胶，120V 20min ,x. 测浓度C）质粒双酶切i. 寻找两种质粒的酶切位点（ EcoRI、Xba I）ii. 在灭菌的Eppendof管中，按下表准备双酶切反应体系：酶切反应体系AvV 口吕号核酸10 x bufferddH2ONot IBamH I115此PEGFP-N32此0止2此1此22山 pET28a2此5止2此1此iii. 37 °C 温育 4hoursiv. 未酶切的质粒作对照，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果① BamH切割识别序列后产生的粘性末端：5'? G J GATCC ?3'宀 5'?G GATCC?3'3'? CCTAGf G ?5' 3'?CCTAG G?5'② Hind III切割识别序列后产生的粘性末端：5'?GC J GGCCGC73― 5'?GC GGCCGC?3'3'?CGCCGG f CG?5― 3'?CGCCGG CG?5'd） 胶回收所需酶切产物片段i. 在紫外灯下从电泳胶上切下所需回收的条带， 注意刀片需消毒， 胶块应尽量小， 使之易融化完全ii. 事先将一个 eppendorf 管称重， 然后将胶块放入后再次称重， 获得胶块的重量iii. 以每100mg胶块加入300卩l的量加入Binding Buffer，查看胶块是否浸在液体 中56C水浴10min以融化胶块释放 DNA，期间每2-3min需取出震荡iv. 待胶块完全融化后按照每 100mg胶块150卩l的量加入异丙醇，充分震荡混匀v. 将 High Pure Filter Tube 安装到 Collection Tube 上vi. 将所有 eppendorf 管中的液体转移到 High Pure Filter Tube 中去，注意不要 超过700卩l，若超过需分两次离心vii. 2000 rpm 离心 1 min ，倒掉收集管中的液体viii. 加入 500 l Wash Buffer 后再次离心 1minix. 倒掉收集管中的液体后再次加 200卩啲 Wash Buffer , 12000 rpm 离心1 minx. 小心将 Filter Tube 取下后装入一个新的 Effendorf 管上xi. 在滤芯的正中加上 30 口1的Elution Buffer，室温放置 1min,12000rpm 离心1 min 。

e） 目的基因扩增i. 设计引物ii. 加入四种脱氧核苷酸原料，底物，引物等iii. 设定 PCR 仪参数iv. 启动 PCR 仪v. （1）起始步骤：将反应混合液加热至 94-98 度以激活 DNA 聚合酶这一步 的时间取决于所选用的 DNA 聚合酶 2）变性步骤： DNA 本身是双链结构， 而 DNA 扩增需要引物与单链 DNA 模 板相结合在这一步，反应混合液被加热至 94-98 度保持 20-30 秒以破坏双 链间的氢键以便释放出单链 DNA这是PCR循环中的第一步3） 退火步骤：变性之后， DNA 模板以单链的形式在反应混合液中存在因 为反应体系中的引物与 DNA 模板互补，当反应温度降至 50-65 度时，引物与 互补的序列形成氢键退火温度主要取决于引物的 Tm 值，通常比引物 Tm 值 低 3-5 度这一步通常维持 20-40 秒，而聚合酶会结合至引物 - 模板双链处开 始 DNA 合成4） 延伸步骤：在这一步， DNA 聚合酶开始 DNA 合成，因此这一步的温度 选取的是 DNA 聚合酶的最优温度通常我们选用 72 度，但某些 DNA 聚合酶 的最适温度是 68 度这一步与体内的 DNA 复制很相似： DNA 聚合酶按照碱 基互补规律将 dNTPs 加到引物的 3'末端最终得到新的 DNA 双链片段。

延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力一般而言 DNA聚合酶每60秒能够合成1kb长度的DNA5） 第2步至第4步称为一个循环：每次循环之后 DNA的量均是前一次的两倍通常一次 PCR反应进行30-35个循环在前几轮的 PCR循环过程中 PCR产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着 dNTPs和引物的量的减少以及DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降， 因此PCR反应的产量也受 到了限制6） 最后的延伸步骤：当 30-35个循环结束后，我们通常会以 68-74度延伸5-10分钟，这是希望使反应体系中残留的单链 DNA全部反应完毕7） 维持时间：通常我们设置 4-16度为反应后PCR产物的保存温度f） DNA的连接重组I.ii.连接的DNA分子具备的条件：具有相同粘性末端（同种酶切的片段）的 DNA 分子比较容易连接在一起， 因为相同的粘性末端容易通过碱基配对氢键形成一 个相对稳定的结构连接反应温度：理论上讲，连接反应的最佳温度是 37摄氏度，此时连接酶的活性最高但37摄氏度粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即 12~16摄氏度此时既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。

本实验选择 16摄氏度5*b 口|__ ha b t辛 a _S 一 BEi£T*您旳诈DM人生怨腐A 3 DNA淫接菊I。