丹参酮ⅡA对破骨细胞形成及分化的影响.pdf

中文摘要丹参酮I I A 对破骨细胞形成及分化的影响摘要目的：本研究旨在利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细胞培养系，探讨丹参酮I I A 对体外培养的破骨细胞形成及分化的影响，为以破骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病的治疗和预防提供一条新思路，为今后进一步深入研究破骨细胞打下基础方法：选用4 周龄S D 雄性大鼠，利用全骨髓细胞培养系及破骨前驱细胞培养系，在1 0 耀M 10 【，2 5 ( O H ) 2 D 3 和破骨细胞分化因子s R A N K L 存在下，进行体外细胞培养，观察丹参酮I I A对破骨细胞形成及分化的影响1 细胞培养及药物添加：1 ．1 全骨髓细胞培养系：取4 周龄S D 雄性大鼠一只，用异氟烷麻醉后，无菌条件下取其胫骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔，然后用1 0 m l 注射器抽取不含血清的伐．MEM 培养液冲洗骨髓腔，提取全骨髓细胞，2 0 0 0 转／分离心5 分钟后，加入含有1 5 ％胎牛血清的仪．MEM 培养液2 0 m l ，吹打混匀后形成细胞悬液，计算细胞数，算出细胞原液浓度，然后配制2 ×1 0 6 c e l l s ／m l 的细胞悬液1 3 m l ，添加活化型双羟维生素D 3 ( 1 a ，2 5 ( O H ) 2 D 3 ) 和破骨细胞分化因子( s R A N K L ) ，使其终浓度分别为1 0 培M ／m l 和2 0 n g ／m l ，然后用2 4 孔培养板播种细胞，每孔加入2 ×1 0 6 c e l l s ／m l 的细胞悬液O ．5 m l( 1 ×1 0 6 c e l l s ) 。

细胞播种后，将培养板放入C 0 2 培养箱内，在3 7 ℃、5 ％C 0 2 及饱和湿度条件下培养，培养至第4 天时中文摘要换培养液～次，共培养7 天1 ．2 破骨前驱细胞培养系：全骨髓细胞提取后，离心浓缩成1 ．5 m l ，然后注入葡聚糖凝胶G 1 0 ( S e p h a d e xG 1 0 ) 中过滤， 除去骨髓间质细胞，搜集非附着性骨髓细胞1 2 —1 5 m l ，然后计算细胞数，算出细胞原液浓度，配制细胞浓度为2 ×1 0 6 c e l l s ／m l 的细胞悬液1 3 m l ，添加活化型双羟维生素D 1( 1 0 t ，2 5 ( O H ) 2 D 3 ) 和破骨细胞分化因子( s R A N K L ) ，使其终浓度分别为1 0 { M ／m l 和2 0 n g ／m l ，然后用2 4 孔培养板播种细胞，每孔加入2 ×1 0 6 c e l l s ／m l 的细胞悬液O ．5 m l( 1 ×1 0 6 c e l l s ) 细胞播种后，将培养板放入C O ，培养箱内，在3 7 ℃、5 ％C 0 2 及饱和湿度条件下培养，培养至第4 天时换培养液一次，共培养7 天。

1 ．3 药物添加：在播种有两种细胞培养系细胞的2 4 孔培养板中添加丹参酮I I A ，使终浓度分别为0 ，0 ．5 ，l ，2 ，5 ，1 0 u g ／m l ， 共加4 行6 列，每行6 个浓度，每个浓度每列4 孔( n - - 4 ) 第一列0 为对照组2 抗酒石酸酸性磷酸酶( T R A P ) 染色：两种细胞培养系细胞在培养至7 天后分别行T R A P 染色，光镜下观察，计算T R A P染色阳性细胞数全骨髓细胞培养系计算3 核以上T R A P 染色阳性细胞数3 统计学分析：使用S P S S1 6 ．0 统计学软件进行分析数据处理采用m e a n + S D 表示，采用方差分析对不同药物浓度相同处理时间，各组与对照组之间相比较丹参酮I I A 对破骨细胞形成及分化的影响，进行统计学分析结果：1 破骨细胞的形态学特征中文摘要1 ．1 全骨髓细胞培养系：在全骨髓细胞培养系中，经TRAP 染色后，可见到大量成熟破骨细胞，其形态学特征为：细胞体积大，呈椭圆形、条索形、漏斗形、油煎蛋形或不规则形胞浆丰满呈紫红色，并伸出许多伪足样突起细胞内可见到几个至几十个不等的细胞核，胞核不着色。

细胞浆内可见到空泡见图( 1 ．5 ) 1 ．2 破骨前驱细胞培养系：在此培养系中，经TRAP 染色后，可见到大量破骨前驱细胞，其形态学特征和成熟破骨细胞相似，只是细胞体积小，细胞核大多为单核，也可见到2核者见图( 6 ，7 ) 此类细胞为不成熟的破骨前驱细胞，如在破骨细胞分化因子刺激下，可相互融合，形成大的成熟破骨细胞2 丹参酮I I A 对破骨细胞形成的抑制在全骨髓细胞培养系中，O ．5 、1 、2 u g ／m l 组与对照组比较，T R A P 染色阳性细胞( 3 核以上) 数仅为对照组的5 5 ．0 4 ％、2 5 ．1 8 ％、9 ．7 1 ％，经统计学分析，加药组对破骨细胞的形成有抑制作用，当药物浓度为1 u ∥m l 时与对照组相比对破骨细胞形成有显著抑制( p O ．0 5 ) 从而推测复方丹参注射液能够抑制破骨细胞的活动，抑制骨吸收张丁等【2 6 】采用兔骨髓体外培养破骨细胞，加入不同浓度的丹参注射液，通过定量分析破骨细胞胞体及核浆比例在加药前后的变化，得出丹参对离体培养的破骨细胞起抑制作用，这与P G E ( 前列腺素) 的作用类似而且丹参可能对破骨细胞的细胞核有一定影响。

但丹参浓度低于0 ．0 1 m g ／m l 时对破骨细胞的抑制作用不明显其机制可能是丹参通过其钙离子阻滞作用，改变了破骨细胞内钙调节蛋白的活性，进而降低了胞浆内C a 2 + 和C A M P 的浓度，使离体破骨细胞的活性降低 2 ) 对骨损伤中的破骨细胞：林润台等【2 7 1 通过动物实验，将健康家兔在下颌角前方下颌骨下缘处造成长方形骨缺损实验组每日每只家兔肌肉注射1 次丹参注射液2 m l ，对照组每日每只家兔肌肉注射生理盐水2 m l ；术后1 0 ，1 4 ，2 1 ，2 8天处死家兔，取骨痂电子显微镜下观察，在用药后可见成团的破骨细胞出现在骨小梁周围，破骨细胞体积大，不规则，核多个，胞质内有许多小圆形线颗粒和小空泡，在空泡内，可见针状钙化组织，其有利于骨的改建用药后成骨细胞数量亦增多邹培‘等【2 阳利用新西兰大白兔动物实验，造成左胫骨中段骨延长模型，实验组于术后第二天开始喂含有中药长骨液( 丹参，土鳖虫，骨碎补，红花，淫羊藿等组成) 颗粒饲料，( 在标准颗粒饲料配方中每只按7 ．5 m l ／k g ．d ) 加入长骨液制成，对照组喂普通饲料实验结束后切取延长区新骨组织，光镜下观察延长区新骨再生与成熟情况。

结果显示两组胫骨中段骨延长情况无明显差异( P > O ．0 5 ) ，而各组胫骨中综述段骨延长的组织学变化却不同，治疗组骨生成细胞的数量，出现的时间及部位都明显强于对照组，加速了新骨组织的成熟；治疗组破骨细胞出现早，而且数量多，功能活跃，从而促进其吸收无用的骨痂，加速新骨的改建过程以上研究表明：丹参对体外培养的破骨细胞有明显的抑制作用，推测其机制是丹参通过其钙离子阻滞作用骨损伤的愈合是创伤愈合的特殊类型，需破骨细胞及成骨细胞等的参与，骨损伤愈合过程中应用丹参后，破骨细胞出现早，且数量多，可促进骨改建过程，加快骨愈合2 ．4 在治疗风湿性关节炎中的作用类风湿性关节炎( R A ) 是一种慢性自身免疫性疾病，具体的病因及发病机制尚不清楚祖国医学则认为R A 属中医瘼证范畴，对本病的病因及发病机制较为一致的观点是：内因是脾胃肝肾气血阴阳不足，卫外不固，而以’肾虚为本；外因为风寒湿热邪气侵袭关节，肌肉，筋骨阻滞经络，气血运行不畅而致血停为痰，痰瘀互结，闭阻经络，深入骨骱而致关节肿胀，畸变，故痰瘀贯穿疾病的始终【2 9 1 ，治疗方法总的来说仍以祛风，除湿，散寒，清热，扶正，逐瘀，剔络为基本大法。

研究发现，当归，丹参，川芎有促进体外培养的兔软骨细胞的合成和代谢功能另有研究证明，丹参可增强成骨细胞的功能和活性，促进新骨生成及骨质修复【2 9 1 胡海等【3 0 1对6 0 例类风湿性膝关节病患者随机分为两组，对照组口服正清风痛宁( 每曰3 次，每次2 片) 治疗组选择髌下外侧穿刺点进针，进针后注射无阻力时，向关节腔内注射丹参酮I I A磺酸钠注射液，每日每侧4 m l ，每3 日1 次两组均以1 个月为1 疗程，连续用药2 个疗程结果治疗组疗效优于对照综述组研究证实P A 在病理过程中伴有的高凝状态可加重关节疼痛、肿胀和功能障碍，丹参可改善血液流变，降低血浆粘度，改变高凝状态从而起到缓解关节炎症的作用丹参还可通过调节免疫达到抗炎的目的以上研究表明，丹参无论是在方剂中还是单独应用，在治疗类风湿性关节炎这一顽疾中均有显著疗效，但其具体机制尚需进一步研究探讨2 ．5 其它药理作用有研究显示【16 】丹参还具有治疗消化性溃疡的作用，机制为改善粘膜上皮细胞增生和粘液分泌，抑制迷走神经兴奋而降低胃运动，减少粘膜皱褶形成而减轻胃粘膜损伤等丹参酮对以金葡菌感染为主的急性感染，特别是对耐药金葡菌有显著疗效，并对丙种毛发菌有抗菌作用。

3 临床应用3 ．1 冠心病及肺心病周文辉【3 ¨将1 6 0 例心绞痛患者分为两组，治疗组给予复方丹参滴丸，对照组给予消心痛研究表明：复方丹参滴丸治疗冠心病，心绞痛，缓解症状有效率明显增强，尤其是对患有偏头痛和对消心痛耐药或易产生严重不良反应的患者更为建用陈方军等【3 2 1 应用丹参联合黄芪注射液治疗肺心病，将6 6 例患者随机分为2 组( 治疗组与对照组) 均采取抗感染，吸氧，解痉，平喘，化痰止咳，纠正水电解质及酸碱平衡，必要时应用小剂量利尿剂，洋地黄类制剂等综合治疗治疗组在此基础上加用黄芪注射液2 0 m l 溶于丹参注射液2 5 0 m l中静点，每日1 次2 组均以1 0 天为1 疗程结果表明：黄综述芪联合丹参注射液治疗肺心病心力衰竭疗效显著3 ．2 治疗瘢痕瘢痕的形成是由于伤口在愈合过程中成纤维细胞的过量增长和胶原纤维过度增生的结果张盘根【3 3 1 研究表明，采用复方丹参注射液，小的瘢痕疙瘩采用外敷法，大的瘢痕采用外敷和局部封闭的方法，结果显示：复方丹参注射液具有疗效强，副作用小，价格低廉，药源广，无副作用等优点，可在各级医院推广应用3 ．3 在慢性根尖周炎中的应用根尖周炎在临床上比较常见，大多数是由于牙髓炎发展而来。

老年患者由于年龄增长，髓腔和根管往往闭锁，常规髓腔根管封药，治疗效果不明显刘爱群【3 4 1 采用局部注射复方丹参注射液治疗多次根管，髓腔封樟脑酚或煤酚醛而不愈的老年慢性根尖周炎1 3 8 例，共2 0 5 个牙，总有效率9 1 ．2 ％3 ．4 眼底出血眼底出血是眼科常见的病症，病因复杂，并发症较多，治疗不及时致盲率高，荣华等[ 3 卯报道，应用丹参酮I I A 磺酸钠治疗4 8 例5 5 眼，采用丹参酮I I A 磺酸钠注射液8 m l 加入体积分数5 ％或生理盐水5 0 0 m l 中，静脉滴注，每天1 次1 4 天为1 疗程1 个疗程后观察疗效，根据患者视力，眼底出血变化评价总有效率达8 7 ．2 7 ％丹参酮I I A 磺酸钠注射是治疗眼底出血的新方法，疗效确切，值得推广应用3 ．5 痤疮痤疮是常见皮肤病，影响容貌，但治疗效果不佳周华等[ 3 印报道，口服丹参酮3 9 ／日，共6 周治疗痤疮，以皮脂溢出率( S E R ) 及痤疮丙酸杆菌计数( P A C ) 为评价标准结综述果显示治疗组总有效率为8 4 ％安慰剂组有效率仅1 6 ％治疗组皮脂溢出率降低4 0 ％，痤疮丙酸杆菌也明显下降，但两者无相关性。

3 ．6 支原体肺炎刘学工等【3 7 1 报道3 8 例肺炎支原体肺炎患儿在应用红霉素治疗的同时，加用复方丹参注射液，结果治愈8 例，显效17 例，总有效率9 4 ．7 ％复方丹参注射液可改善肺及支气管微循环，可缩短病程，提高疗效丹参及其提取物在临床上已广泛应用，但丹参的药理及其有效成分尚需进一步研究，随着研究的。