激光共聚焦显微成像技术在植物细胞微丝骨架三维动态观察中的应用.pdf

现代仪器 ()二○一○年·第五期50激光共聚焦显微成像技术在植物细胞微丝骨架三维动态观察中的应用薛秀花1 张晓嫣1 郑 东2 任海云1（1.北京师范大学生命科学学院 细胞增殖及调控生物学教育部重点实验室 北京 100875） （2.北京师范大学分析测试中心 北京 100875） 摘 要 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope, LSCM）是目前生 物学领域应用最广泛、分辨率高的仪器可用于细胞内形态结构观察及三维重建、组分 空间定位、实时动态变化监测等研究，图像分析软件还能提供荧光强度、空间距离定量 测定的丰富信息本文以携带 GFP 融合拟南芥丝束蛋白 1(AtFIM1) 的肌动蛋白结合结构 域 2（fABD2）基因的 BY-2 转基因细胞系为材料，运用 LSCM 技术观察到间期细胞的 网络状微丝结构并重构出胞内微丝的三维网络结构 ； 实时动态监测细胞有丝分裂过程中 微丝骨架的动态变化 ； 通过细胞内荧光强度的分布直观地看出 BY-2 细胞胞质分裂过程 中微丝骨架的动态变化这些结果显示出 LSCM 在研究植物细胞微丝骨架的三维网络动 态结构及图像荧光强度分析与统计方面的优越性。

关键词 激光共聚焦显微镜 微丝骨架 肌动蛋白结合蛋白 三维动态 BY-2 细胞 胞 质分裂细胞颗粒的运输等，维持细胞的形状，参与细胞顶 端生长，细胞壁构建，细胞器定位等微丝骨架通 常是通过迅速的聚合解聚来调整和改变其形态，从 而在细胞执行各种功能及应对外界刺激时维持细胞 正常的生理活动 细胞中的微丝骨架的动态变化直接受肌动蛋白 结合蛋白（actin-binding proteins, ABPs）的调节 ABPs 通过与单体肌动蛋白（G-actin）或丝状肌动 蛋白（F-actin）结合，调节二者之间的动态平衡， 进而调控微丝骨架的组织和功能ABPs 的活性又 受诸多其他因素的调控，诸如 Ca2+、 pH、 磷酸化等等，因此微丝骨架能通过 ABPs 对细胞内外信号作 出的反应，从而参与细胞内的各种生理活动[2~6]目前为止，动物细胞中已知 160 多种 ABPs[7] , 按 照其与肌动蛋白的相互作用方式可分为单体肌动蛋 白结合蛋白（monomer actin binding proteins） ，封 端蛋白（capping proteins） ，侧面结合蛋白（lateral binding proteins） ，交联蛋白（crosslinking proteins） 及成核蛋白 （nucleating proteins）等。

随着动物细胞中 ABPs 研究的日趋完善，近年 来有关植物肌动蛋白结合蛋白的研究也成为热点问 题植物肌动蛋白结合蛋白的研究工作主要集中在 它们的体外生化性质、体内对胞内微丝结构的影响 及其参与的植物生长发育调节等方面 细胞内微丝骨架是高度动态的网络结构，采用 合适的标记探针对体内的微丝骨架进行标记、获得引 言 激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confo-cal microscope, LSCM）是 20 世纪 80 年代发展起来的一种结合激光扫描、显微镜技术与计算机自动化分析的仪器它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针产生信号，利用计算机进行图像处理，可以获得高分辨率、高质量的图像通过针孔成像，还可以对样品进行直接无损伤的光学断层扫描，进而实现立体结构的三维重建以及空间结构和荧光强度信息LSCM 主要由激光光源、 扫描器（内装有针孔光栏、分光镜、 发射荧光滤光片及检测器） 、 荧光显微镜 （装有微量步进电动机）系统、光学装置、计算机存储与处理及控制系统等部分组成[1]目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞内形态结构观察及三维重建、组分空间定位、实时动态变化监测等研究，图像分析软件还能提供荧光强度、空间距离定量测定的丰富数据信息。

不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞进行结构、定位、定性、定量分析及动态监测，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学及遗传学等领域得到广泛应用 微丝（microfilaments，MF） ，又称肌动蛋白纤 维 （actin filament） ， 是真核细胞中由肌动蛋白 （actin） 组成，直径为 7nm 的骨架纤维参与细胞内的多 种生理活动，如胞质流动，肌肉收缩，细胞分裂，51二○一○年·第五期研究报告可视化效果强的图像，是研究体内微丝骨架形态结 构及动态变化的重要前提随着发光蛋白的发现， 植物体内微丝骨架的标记方法也从利用微丝的特异 性药物向着构建发光蛋白与某种可以特异结合微丝 的蛋白或肽段构成的融合蛋白方向发展Kost 等 人最先使用 GFP 与小鼠 talin 蛋白 C 端的肌动蛋白 结合结构域构成融合蛋白（GFP-mTn）在植物体内 标记微丝[8,9]随后，Timmers 将 GFP 与一种微丝结合蛋白——拟南芥丝束蛋白 1（AtFIM1）构成融 合蛋白（GFP-AtFIM1）用于标记微丝[10]Sheahan等又构建 GFP 与 AtFIM1 的肌动蛋白结合结构域 2 （fABD2）的融合蛋白，并且证明这种探针能够显 示出 GFP-mTn 和 GFP-AtFIM1 所不能标记的更加 精细、动态的微丝结构[11~13]。

以本实验室已构建好的携带 GFP-fABD2 基因的 BY-2 悬浮细胞系为 材料，观察到细胞间期成网络状态的微丝骨架及随 着细胞有丝分裂过程的进行而处于不断动态变化的微丝骨架结构有丝分裂细胞中的微丝结构可参与 成膜体组成和细胞板延伸这些实验方法的建立为 进一步研究各种肌动蛋白结合蛋白的体内功能及其 在细胞周期过程中与微丝的关系提供基础1 实验部分1.1 材料 植物材料为携带 GFP-fABD2 融合基因的烟 草 BY-2 转基因细胞系[12]携带 GFP-fABD2 融合基因的过表达拟南芥种子由德国波恩大学 Diedrik Menzel 博士惠赠荧光染料 FM4-64 [N-(3-triethy lammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl) hexatrienyl)-pyridinium dibromide] 购自 Invitrogen 公司， 潮霉素 Hyg (Hygromycin B) 购自 Roche (Ger- many) 公司 ； 试验所用无机盐均为分析纯 BY-2 细胞液体培养基（改良的 MS 培养基 1964）[14]： MS植物盐混合物 （M5524， Sigma） : 4.33 g；蔗糖 : 30 g ； KH2PO4 溶液 (20 g/L): 10 mL ； Thia- mine HCl (1 g/L): 1 mL;2,4-D (200 mg/L): 1 mL ； myo-inositol (20 g/L): 5 mL ； 加三蒸水至 1000 mL， 调 pH 5.8。

固体培养基含 0.8 % 的琼脂 1.2 仪器 激光共聚焦显微镜 LSCM（Olympus IX70— FV300, Japan） ，普通荧光显微镜（Zeiss Axio Im- ager. A1） ，全温振荡培养箱 HZQ-F160，生化培养 箱 HPS-4001.3 试验方法 BY-2 愈伤组织静置培养在 27℃避光的生化 培养箱 HPS-400 中，每月更换新鲜固体培养基 BY-2 悬浮细胞震荡培养在 27℃避光且转速为 130 rpm 的全温振荡培养箱 HZQ-F160 中，7 天继代更 换新鲜培养基 携带有 GFP-fABD2 融合基因的农杆菌介导转 化烟草 BY-2 愈伤组织 : 转化方法参考[9]FM4-64 活染 BY-2 悬浮细胞 ： 取 200 μL 生长 良好的 BY-2 悬浮细胞 ； 2 µmol/L FM4-64 ( 母液浓 度为 2 mmol/L, 以水溶解常温保存 )，避光处理 5 min; 用 BY-2 细胞液体培养基洗 1~2 次，去掉多 余的染料 ； 制片观察 LSCM 检测选择参数 ： 激光光源为 10 mW 氩 离子激光器，可输出波长 488 nm； z 轴步距： 0.5~0.8 µm ； 扫描方式 ： Kalman 扫描或 XYZT 扫描模式 ； 扫描速度 ： 中速 ； 物镜 ： 60×oil。

活体细胞内微丝 结构按 z 轴步距逐层往细胞底部进行断层扫描，获 取高分辨率的多层叠加图像或三维立体图像采集 所得图像通过 Olympus 软件 Fluoview 4.0 和 Photo- shop 7.0 处理并进行图像重组2 结果2.1 LSCM 与普通荧光显微镜成像的比较 用带 GFP-fABD2 标记的转基因拟南芥植株观 察根细胞内的微丝排列情况时比较普通荧光显微镜和 LSCM 在微丝骨架结构观察的应用图 1A 展示 的是用普通荧光显微镜拍摄的根下胚轴部位细胞内 的微丝结构，只能看到一些主干微丝结构无法看到 胞内精细微丝和微丝的整体网络结构由于普通荧 光显微镜采用的是一种场光源其摄影为场摄影同时 包含焦点和非焦点的影像，受到物镜分辨率和切片 厚度的制约，标本上每一点的图像都会受到邻近点 的衍射光或散射光的干扰，故看到的绿色荧光分 布弥散且部分呈现模糊状图 1B 是利用 LSCM 的 光学切层性能观察拟南芥植株根细胞内的微丝结 构此图是按照步距 0.8µm 由根的底层切至最上 层后叠加后的结果可以看到在质膜下层围绕着清 晰的微丝网络，胞内还存在大量长的跨越整个细胞 的微丝索结构。

相比普通荧光显微镜，LSCM 对标 本上的每个点都是在焦点上的摄影 , 其在 X-Y 平 面上的最佳分辨率可达 0.2~0.25 μm, 较普通显微 镜要高出 40%; 在 Z 轴上的最佳分辨率可达 0.5~0.6 μm[15]由于 LSCM 可以更加真实地展现出植物细现代仪器 ()二○一○年·第五期52胞内清晰的微丝网络结构，所以主要用 LSCM 来 观察携带有 GFP-fABD2 融合基因的烟草 BY-2 悬 浮细胞内微丝网络结构图 1 拟南芥下胚轴细胞内的微丝排列A. 普通荧光显微镜拍摄的图像； B. LSCM 扫描的图像标尺为 20 µm 2.2 BY-2 间期细胞微丝网络结构的观察取继代培养 3~5 天的悬浮细胞进行显微观察利用 LSCM 可直接、无创性地对样品进行连续光学切片，观察同一标本表面和内部结构的特点，对转基因的悬浮细胞进行切层观察采集图像时所用方法中所介绍的参数其中 z 轴步距为 0.8 µm ； 扫描方式 ： Kalman 扫描 ； 扫描范围 ： 目的细胞的最外层周质至横切最宽面图 2 所展示的是 BY-2 间期细胞内从周质到核周不同切面的微丝结构在紧贴质膜下的胞质中可以看到存在大量排列成网络状的微丝BY-2 细胞内的微丝骨架是一个高度动态的结 构，这种高度动态的特性在细胞有丝分裂期表现得 尤为明显。

LSCM 荧光检测器可以毫秒级或微秒级 的速度检测荧光，具有较高时间分辨率，同时可对 活细胞在无损伤处理的情况下进行观察，因此可以 跟踪活细胞内的物质、结构和生理过程随时间变化 的情况，得到实时动态的连续图像[17]为观察细胞有丝分裂过程中微丝骨架的变化情况，吸取 50 μL GFP-fABD2 悬浮细胞放入型号为 GWSt-3512 直径为 22 mm 的玻璃底培养皿中，直接在激光共 聚集显微镜下实时观察，清晰的观察到微丝骨架在 有丝分裂期的动态变化过程对所观察到的细胞分 裂过程进行图像采集所用参数如方法中所介绍，其 中 z 轴步距 ： 0.5 µm ； 扫描间隔时间 T ： 5 min; 扫 描方式 ： Kalman 扫描 ； 扫描。