急性肝损伤研究.doc

急性肝损伤动物模型研究进展急性肝损伤动物模型研究进展目前，国内外对肝损伤的防治仍是一个严峻课题选择合适的肝损伤模型是做好防治 肝损伤研究的前提通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药 物，探索保肝作用原理，具有十分重要的现实意义本综述将目前应用较多的模型做一列 举分析 一、化学性肝损伤一、化学性肝损伤 1. 四氯化碳肝损伤 CCl4是一种常用的诱发化学性肝损伤模型的剧毒类化学药物之一，因其接触后发病率 高易在动物实验中复制，能准确反映肝细胞的形态学变化，在研究保肝降酶药的实验中 经常使用[1] CCl4引起肝损害的主要机制是 CCl4经肝微粒体细胞色素 P450(Cyt1 P450)活化后生成 三氯甲基自由基(·CC13) ，在其启动的过氧化连锁反应中，生毒性作用更强的二氯甲基自 由基(·CC12)及过氧化甲基自由基(·OOCC13) ,这些自由基攻击肝细胞膜的多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid ,PUFA) 引发脂质过氧化[2] CCl4溶于植物油，配制 0.1 %-0.2%浓度，按 10 ml/kg 小鼠腹腔注射，或灌胃 0.1 %～0.2 %，或皮下注射 0.5 %，12～24 h 内处死动物。

测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草 转氨酶 (AST)等反应肝功能的指标；肝匀浆超氧化物歧化酶 (SOD)，脂质过氧化物(LPD) 或丙二醛(MDA)等反映脂质过氧化的指标，肝脏取同一部位进行组织病理学检查 此模型是肝损伤的经典模型，应用最多，能准确反映肝细胞的功能、代谢及形态学变 化，重复性好但缺点是 CCl4 还同时损害动物的其他多种脏器，此外，CCl4 挥发性较大， 可经人体多种途径吸收，故对实验人员具有一定的中毒危险性 2. D-半乳糖胺肝损伤 D-半乳糖胺（ D-GalN） ，又名 D-氨基半乳糖， 是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰 剂，可造成肝弥漫性坏死和炎症，与临床病毒性肝炎的肝脏病理变化相似 D-氨基半乳糖 (D-galactosamine, GalN)通过消耗肝脏尿嘧啶三磷酸核苷酸，抑制 肝细胞 RNA 合成GalN 与微量细菌脂多糖 ( lipopolysaccharide, LPS)共处理后，小 鼠对 LPS 敏感性明显增强，引起小鼠急性肝脏损伤，伴有严重肝脏充血和坏死，甚至 出现死亡[3]另外 D-GalN 还可以引起肝细胞内 Ca2+增多，Mg2+ 减少，Mg2+/Ca2+ 的比例失调[4]，这可能也是 D-GalN 导致肝细胞不可逆损害的因素之一 。

用无菌生理盐水配制成 100 g/L 的 D-氨基半乳糖溶液， 并用 1 mol/L NaOH 调节 其 pH 值至 7.0大鼠或小鼠腹腔注射 600-900 mg/kg 和 LPS 10μg/kg，造成急性肝损 伤模型，染毒 24-48 h 内处死动物，检查肝功能、脂质过氧化指标及组织病理学 该模型肝脏组织病理学改变和生物化学的变化均与人类病毒性肝炎极为相似，也能 发展为肝性脑病，其可逆性和重复性均较好[4]而且 D-GalN 肝毒性的专一性较其他肝毒物较好，对实验人员也无危险因此， D-GalN 性肝损伤模型是目前公认的比较 好的研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物的实验动物模型 3. 对乙酰氨基酚肝损伤 对乙酰氨基酚亦名醋氨酚、扑热息痛 (acetaminophen ,paracetamol ,AP,APAP)， 是替代阿司匹林的解热镇痛药，大剂量或长期服用时，可导致严重毒性效应，尤以肝脏 小叶中央型坏死为常见 AP 造成的肝损伤是目前国际上常用的模型 AP 致肝损伤机理主要是其代谢过程中产生 N-乙酰-对苯醌亚氨 (NAPQI)，耗竭 肝细胞还原型谷胱甘肽，降低肝细胞抗氧化能力，继而使肝细胞产生氧化应激性损伤。

NAPQI 还可以与生物大分子共价结合，导致蛋白质巯基被氧化和芳基化而影响它们的功能此外 ，对 AP 在肝内代谢过程中产生自由基可引起肝细胞膜脂质过氧化，并通 过破坏钙稳态而产生细胞毒性虽然在AP 诱导的肝损伤模型中氧化损伤是导致肝细 胞亚显微结构破坏而引起肝细胞坏死是肝损伤的主要原因，但细胞凋亡也参与肝损伤过 程[5] 加热下溶于生理盐水，给小鼠300-500 mg/kg 一次性腹腔注射[6]，也可配成质量浓度为 2.5 %的混悬液经口灌胃 ，制成急性肝损伤模型 ，染毒 24 h 后处死动物，眼 眶取血，检查肝功、病理及脂质过氧化等有关指标 王宪龄[7]等通过该模型比较柴胡和黄芩不同剂量比例配伍对小鼠肝损伤的保护作用 模型组灌胃给予扑热息痛混悬液 (500 mg/ kg ,1 %CMC - Na 配成 2. 5 %的混悬液) 20 ml/kg，24 h 后脱颈椎处死小鼠 ，测定各种指标 结果显示模型组的 ALT、AST 含 量均较空白组有明显升高，血清和肝匀浆中GSH 明显下降 AP 为临床常用的解热镇痛药 ，每日 25 mg 治疗剂量下较安全 ，AP 所致肝损伤 ， 主要导致肝脏对 AP 代谢能力受限 ，最终导致肝细胞变性坏死 ，过量或长期使用 可使 肝脏产生不同程度的损害， 故 AP 制备的肝损伤模型不及前两模型常用 。

4. 其他化学损伤 雷公藤多苷片、异烟肼、四环素等所致的肝损伤[8]二、免疫性肝损伤二、免疫性肝损伤 肝脏内免疫反应是引起病毒性肝损伤的主 要机制之一 ，因此以免疫学机制诱导的 肝损伤模型建立 ，为肝损伤研究开辟了新途径 ，对研究病毒性肝炎防治具有重要意义 1、卡介苗加脂多糖诱导法 模型的机理在于预先给动物注射卡介苗 ，可使多核中性粒细胞或巨噬细胞聚集于 肝，继后再用脂多糖攻击注射 ，可激发这些细胞释放对肝细胞有毒性作用的可溶性因 子，造成免疫性肝损伤 给小鼠尾静脉注射卡介苗 (BCG)浆液 0.2 ml/只(含 5 ×106 个菌以上) ，致敏后 10 d，再尾静脉注射脂多糖 (LPS) 7.5μg/只，16 h 后测定肝功、病理、脂质过氧化及 TNF-α 等有关指标[9]肖柳英[10]等通过该模型研究荔枝核对小鼠急性肝损伤的保护作用，模型小鼠 iv 卡介苗(BCG)5×106 个菌/ 鼠，11 天后末次给药前 16h 再 iv 脂多糖(LPS)7.5μg/ 只， 眼眶取血测指标，实验结果表明小鼠卡介苗加脂多糖诱导法造模成功 该动物模型与用化学物质造成的肝损伤模型比较，在病理机致上更接近人体的肝 炎。

2. 刀豆蛋白 A 诱导法 刀豆蛋白 A（Con A）是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的 促淋巴细胞转化反应的作用，还能选择性激活抑制性T 细胞（Ts）细胞，对调节机 体免疫反应具有重要作用 Con A诱导的肝损伤模型依赖于有免疫活性的细胞引起肝损伤，其效应细胞是细胞 和单核巨噬细胞， 当给动物静脉注射 Con A 后，Con A 与循环中的常驻巨噬细胞成 分组合，然后活化肝细胞中的 T细胞，对肝细胞造成损伤 ，因此Con A 对肝脏有器官 特异性在 Con A 诱导的肝损伤模型中 ,淋巴细胞或者单核细胞以及肝脏中的 kuppffer cells 通过炎症反应参与了损伤过程 ，它们进一步激活肿瘤坏死因子 TNF- α，继而通过调亡机制 损坏实质细胞[11]小鼠直接一次性尾静脉注射 Con A 20 mg/kg 制成急性免疫性肝损伤模型 ，2-8 h 后取样测定肝功能、病理及脂质过氧化指标[12]蔡欣[13]等利用刀豆蛋白 A致小鼠急性肝损伤模型，分析并评价模型效果模型组 尾静脉注射生理盐水， 6h后按每克体重 10μg尾静脉注射 Con A，16h及32h后取血处死 检测各种指标。

实验结果表明，与对照组比较16、32 h后，模型组小鼠血清 ALT及 AST值显著升高病理切片结果表明，模型组小鼠注射Con A 16h后，与对照小鼠相 比，肝细胞受到损伤，胞质肿胀模型组小鼠注射 Con A 32h 后，肝脏几乎完全水 肿坏死，伴炎性细胞浸润，且可见大量肝细胞核破裂、凋亡小体等 该模型发病迅速 ，肝脏损害明显 ，短期内即可快速地诱导临床和组织学的肝炎 三、酒精性肝损伤三、酒精性肝损伤 乙醇及其在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物所引起的代谢紊乱是导致酒精性肝损 伤的主要原因[14]乙醇所致肝损伤的重要机制之一是激活氧分子产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化体内依赖性抗氧化系统中以GSH 在抵抗酒精所致的肝损伤中 起关键作用 ，酒精在体外和体内均可使肝脏GSH 含量显著降低 ，GSH 含量的减少可 能是酒精导致肝脏脂质过氧化增强的原因之一[15]1、急性酒精损伤 小鼠或大鼠体积分数为 50%～60%的乙醇一次性或连续几天经口灌胃4.0-6.0 ml/kg ，2-24h 内处死动物，检查肝功能、 脂质过氧化、 病理形态学指标 郭科南[16]等利用急性酒精损伤模型，研究苦碟子注射液对急性肝损伤大鼠的影响， 模型组每天禁食不禁水， 6 h后按7.0 m l/kg给大鼠灌胃 50%乙醇，1 h后重复1次，连 续5 d。

末次造模16h 后取血检测结果发现模型组大鼠灌胃后出现醉酒症状，大约 2 h后转醒较空白组情况差，食欲下降，毛发光泽度差，体重增缓慢；与空白组比 较，模型组血清 ALT、AST水平均有明显升高，血清 GSH含量明显降低，肝匀浆 SOD 水平明显降低，肝匀浆 MDA显著升高 2. 慢性酒精损伤 大白鼠以50-60度白酒或50 %-60 %的乙醇经口灌胃 2. 4-5. 0 g/kg，每日1次，连续2 个月每天同时喂饲造模饲料 ，即营养不良饲料 (面粉∶次粉∶草粉∶豆粉2∶1∶1∶1 比例配 方，另加少量豆油及食盐 ) ，正常对照组喂饲常规饲料 ，末次染毒后 24 h 取样测定 有关指标慢性酒精性肝损伤的诊断主要靠病理学检查[17]张宇[18]等通过慢性肝损伤实验，观察茶多酚对该模型所致肝损伤大鼠的影响，模 型组以56%体积分数白酒折算成酒精灌胃 1次/d ，大鼠于灌胃 4周末、12周末和24周 末称重后，取血处死测指标结果表明，模型组肝体积增大，质地较空白组粗硬，色 泽较暗淡；模型组血清 ALT、AST水平均较空白组有明显升高；肝细胞浆出现不同程 度的空泡变性，重者胞体肿大气球样变实验通过不同时间造模，还发现酒精组大鼠肝 脏病理检查显示了不同程度的脂肪变性和炎症改变表现。

早期以酒精性脂肪肝为主，可 见部分大鼠肝小叶中心带部位的肝细胞中出现大小不等的脂肪滴而后期以酒精性肝炎的 表现为主，大鼠的肝小叶均可见肝细胞点状或灶状坏死 应用大鼠酒精性肝病模型 ，必须考虑大鼠与人类种属的 3 个不同特点：大鼠对酒 精天生的反感；大鼠体内对酒精的代谢速度较人类快3-4 倍；大鼠对酒精的耐受性高四、其他损伤四、其他损伤 1. 高强度聚焦超声 该方法是治疗实体肿瘤如肝癌的一种新方法，其治疗的机理目前尚不完全清楚，可 能与聚焦超声在体内产生的高热效应、空化效应和机械效应及对肿瘤血管的破坏有关[19]2. 镉镉是环境中广泛存在的重金属毒物之一 ，急性镉暴露可以损害机体多种靶器官组 织，如肾脏和肝脏等镉对肝、肾的损害与氧化损伤、氧化应激密切相关[20]镉致急性肝损伤与镉诱导的氧化应激 ，从而引发的自由基损伤密切相关[21]综上所述，近几年来国内外有关肝损伤模型的研究取得了很大进展，但上述肝损伤 动物模型都各具优缺点，还需进一步完善 ，且急性肝损伤机制 复杂，选择较适合的研 究模型，尚需 深入研究参考文献 [1] 邹丽宜,吴铁,崔燎．四氯化碳对大鼠肝毒性的时量关系研究[J]．中国临床药理学与治疗 学，2003，8(2)：158—162. [2] 何萍, 黄仁彬,林军,等. 乙肝转阴散对小鼠四氯化碳急性肝损伤的保护作用[J]. 广西医科 大学学报,2006,23(5): 732-733. [3] Decker K, Kep。