基于荧光金纳米簇靶向探针在活细胞成像和药物运输中研究.pdf

密级: 博士学位论文博士学位论文 基于荧光金纳米簇的靶向探针在活细胞成像基于荧光金纳米簇的靶向探针在活细胞成像 和药物运输中的和药物运输中的研究研究 作者姓名: 庄庄 欠欠 粉粉 指导教师: 刘刘 扬扬 研究员研究员 学位类别: 理学博士理学博士 学科专业: 物理化学物理化学 培养单位: 中国科学院化学研究所中国科学院化学研究所 2014 年 4 月 Fluorescent gold nanoclusters as a targeted marker for imaging and drug delivery of living cells By Qianfen Zhuang A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Physical Chemistry Institute of Chemistry Chinese Academy of Sciences April, 2014 致 谢 I 致 谢 三年的博士生活即将结束，在这里我要衷心的感谢实验室的所有老师和同 学对我的帮助和支持。

首先感谢我的导师刘扬研究员，刘老师为我们提供了一个发挥能力的平 台，经过在实验室三年的学习工作，使我能够在科研过程中的各个方面充分地 锻炼自己，培养了自己各方面的能力，相信这三年的锻炼将使我在今后的人生 道路中受益匪浅刘老师严谨的治学态度,敏捷的思维，勇于开拓的创新精神令 我钦佩，教会了我如何做一个优秀的科研人员刘老师乐观的生活态度、博大 的胸怀，时时处处言传身教，促我成长教我做人，刘老师传授我们的做人的道 理将使我受用一生在此，我谨向刘老师表示最崇高的敬意和最由衷的感谢！ 感谢田秋老师在生活上的关心和帮助，在我遇到困难的时候给了我很大的 帮助和安慰，在此表示由衷的谢意 感谢贾宏瑛老师对我的学习和生活中的无私帮助和指导在我的工作中得 到了贾老师的精心指导，在生活中贾老师就像姐姐一样给了我信心和勇气，还 有温暖的关怀，真的很感谢 感谢杜立波老师在生活上的关心和帮助以及对实验所给予的巨大的帮助和 指导，杜老师为人乐观、热情、善于交往深深地影响了我，自从来到化学所实 验室以来，杜老师一直给予耐心的指导和帮助，在此表示由衷的感谢 感谢毛兰群研究员和于萍师姐对我的学习和生活给予的帮助和支持 感谢舍友陈红和吕冬梅在生活和学习中给予的帮助和支持，遇到你们真 好。

感谢分子动态稳态实验室高艳丽、斯琴高娃、苗晓翔、冷振华、毕继安、 王兵、刘锦梅、李砚超、陈招、黄赛鹏、李虹、张晗等同学感谢你们对我的 生活和学习上给予的无私帮助和关心，我会珍藏和你们在一起度过的美好时 光 感谢我的爱人王勇，感谢你一直以来对我的忍让和关心，是你的理解和支 持，陪我度过挫折和困难，希望在以后的日子里我们一起成长，真心谢谢你 致 谢 II 特别感谢生我养我的父母，他们给了我无私的亲情和关爱、无限的理解和 支持，他们是我一直能够坚强面对生活、克服困难、勇敢生活的动力是他们 无私的付出和关爱，才有了我的今天，在此我表示深深地感谢 感谢所有关心、帮助过我的人，感谢你们 庄欠粉 2014 年 4 月 16 日 摘 要 III 摘 要 随着细胞生物学的发展，对于细胞及细胞器的功能研究引起了广泛的关 注目前报道的传统方法一般采用半导体量子点和有机染料进行靶向荧光标记 细胞或细胞器而上述荧光标记方法却存在着细胞毒性高（半导体量子点）、 易光漂白（有机染料）等缺点，限制了其在细胞成像领域的广泛应用近年来 出现的金纳米簇（AuNCs）以其特有的荧光强度高、光稳定性好和细胞毒性低 等优点，已经被广泛应用于生物分子、细胞和活体成像、生物传感器等生物医 学研究领域。

AuNCs 的发展为细胞生命活动表征提供了新的标记材料，与传统 半导体量子点和有机染料相比，其在光稳定性和低细胞毒性上有极大的优势 基于此，本文开展了 AuNCs在细胞及细胞器靶向成像和药物运输中的研究： 1. 功能化的金纳米簇在活细胞线粒体靶向成像中的研究 线粒体在生命活动中起着重要作用，与许多疾病的发生发展密切相关，因 此对线粒体进行标记和成像对于了解细胞生命活动和疾病的预防具有重要意 义然而传统的有机染料和半导体量子点分别由于光稳定性差、细胞毒性高等 缺点限制了其在生物成像中的应用为解决上述问题，本文设计合成了 AuNCs，然后以生物相容性的壳聚糖纳米颗粒（CS）为载体，通过疏水作用将 AuNCs 负载到 CS 中，随后共价修饰线粒体靶向分子 TPP，进而制备了新型的 活细胞线粒体靶向探针（AuNCs@CS-TPP）然后对其进行了一系列表征，结 果显示，所制备的 AuNCs@CS-TPP 荧光发射峰在 440 nm，荧光量子产率为 8.5%同时，AuNCs@CS-TPP 标记的宫颈癌细胞（HeLa）经过激光连续激发 8 min 后，荧光强度几乎没有明显减弱毒性分析显示，当 AuNCs@CS-TPP 的浓 度高达 60 μg mL-1时，仍然没有对 HeLa细胞和肝癌细胞（HepG2）造成明显的 毒性。

另外，通过和商业化线粒体探针（Mito tracker）共定位成像后，发现 AuNCs@CS-TPP 可以选择性的定位于 HeLa 细胞和 HepG2 细胞结果表明， AuNCs@CS-TPP 具有强光稳定性、低细胞毒性、高灵敏度和线粒体靶向性，这 使其可以用于活细胞线粒体的靶向标记和成像 2. 金纳米簇功能化的壳聚糖纳米载体在癌细胞靶向成像和药物运输中的研究 癌症是当今严重威胁人类健康和生命的疾病之一目前临床应用的大部分 的抗癌药因其水溶性差、靶向性差、毒副作用大、难以追踪等缺点而限制了应 用纳米技术的发展为上述问题的解决提供了一种新的方案我们以抗癌药甲 摘 要 IV 氨蝶呤（MTX）为例，设计合成了基于 AuNCs 的具有癌细胞靶向成像和药物 运输功能的纳米 MTX首先合成了低毒性的谷胱甘肽保护的金纳米簇 （AuNCs），然后共价修饰到 CS 表面，再静电修饰癌细胞核仁素靶向分子 （AS1411）后，制得了可以同时靶向成像和运输的 CS 纳米载体（AuNCs-CS- AS1411）通过荧光分光光度计、动态光散射仪、透射电子显微镜对其荧光、 粒径和形貌对其进行了一系列表征荧光光谱显示，AuNCs-CS-AS1411 发射峰 在 609 nm，可以发出明亮的红光。

药物负载和释放实验显示，AuNCs-CS- AS1411 对 MTX 的负载率为 13.8%，且对其可控释放通过在紫外激发、pH 和 存储时间的影响下，发现 AuNCs-CS-AS1411 具有良好的稳定性细胞摄取实 验表明，AuNCs-CS-AS1411 可以快速的被 HepG2 细胞摄取，同等条件下只有 微量的 AuNCs-CS-AS1411 可以进入正常肝细胞（LO2），上述结果说明 AuNCs-CS-AS1411 可以实现癌细胞靶向性细胞毒性实验表明 AuNCs-CS- AS1411对 HepG2细胞和 LO2细胞在浓度为 200 μg mL-1时，仍没有造成明显毒 性，展现了较好的生物安全性性当其负载 MTX 后，在 MTX 浓度为 20 μg mL-1时，相对比 LO2 细胞，明显对 HepG2 的毒性增强，证明 AuNCs-CS- AS1411 可以实现靶向药物运输结果表明，所合成的 AuNCs-CS-AS1411 具有 荧光强度亮、稳定性好、细胞毒性低、可控释放、癌细胞靶向性等特点，可以 实现同时用于癌细胞的靶向成像和药物运输 3. 壳聚糖纳米抗癌药的制备与体外抗癌研究 在实验室前期工作的基础上，我们对疏水性抗癌药物负载的 CS 纳米抗癌 药物的抗癌效果做了进一步的研究。

以 MTX 和喜树碱（CPT）作为代表药物， 通过疏水作用，将抗癌药负载到 CS 中，制备了壳聚糖纳米抗癌药（MTX@CS 和 CPT@CS）利用扫描电子显微镜、动态光散射仪和紫外-可见光谱对其进行 了一系列表征结果显示，所制备的纳米抗癌药为球形的、单分散的、粒径约 为 38 nm 的纳米颗粒药物负载和释放实验显示，对 CPT 和 MTX 的负载率分 别为 12.3%和 14.2%，且对药物具有 pH 响应的可控释放细胞摄取实验表明 CS 可以短时间进入细胞，且通过溶酶体途径包吞进细胞以肺癌细胞 （A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG2）为例，通过细胞毒性 实验考察纳米抗癌药的治疗效果，结果显示和抗癌药单体相比，纳米抗癌药对 三种癌细胞具有更明显的抗癌作用以上结果表明基于 CS 所制备的纳米抗癌 摘 要 V 药具有水溶性好、可控释放、毒副作用小等优点，可以增加药物的利用度，提 高对癌细胞的治疗效果 关键词关键词：金纳米簇，壳聚糖，靶向探针，细胞成像，药物运输 Abstract VI Abstract With the development of cell biology, targeted labeling cells or organelles have attracted much research interest. Conventional organic dyes and quantum dots have been developed in mitochondrial imaging, but their poor photostability and cytotoxicity often limits their application in living cells studies, leaving much to be desired. Unlike the traditional luminescent imaging agents (e.g., organic dyes and quantum dots, QDs) the AuNCs, which have been widely used in the field of biological molecules, cells and living fluorescence imaging and biological sensor, becomes the next generation imaging probes because of their high fluorescence intensity, good photostability and low toxicity, gold nanoclusters (AuNCs). Based on the above description, the study on cells and organelles imaging, drug delivery were proceeded which can be concluded as follows: 1. Targeted surface-functionalied gold nanoclusters for mitochondrial imaging Due to mitochondria involved in both apoptotic and necrotic cell death, labeling and imaging mitochondria has attracted considerable interest. 。