时间分辨荧光免疫技术培训.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,广州市源起生物工程有限公司,时间分辨荧光技术,广州市源起生物科技有限公司,培训,主要内容,时间分辨荧光免疫技术（,TRF,）定义TRF,的标记物及特点为什么叫“时间分辨”,?,TRF,在免疫分析方法学中的地位各种免疫方法学的比较临床应用,回顾标记免疫学发展,放射免疫（精度：10,-12,mol/L）,酶联免疫（精度：10,-9,mol/L）,胶体金标记（金标：10,-15,mol/L）,化学发光（精度：10,-15,mol/L）,电化学发光（精度：10,-17,mol/L）,时间分辨荧光（精度：10,-18,mol/L）,生物芯片,时间分辨荧光技术,（Time-Resolved Fluorescence）,时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）,时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA）,时间分辨荧光核酸探针分析,时间分辨荧光细胞活性分析,时间分辨荧光探针分析,时间分辨荧光技术原理（TRF）,用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；,当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。

根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的时间分辨荧光免疫原理图,（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）,时间分辨荧光免疫试剂工作原理示意图,微量反应孔,包被好的表面抗体,表面抗原,V,标,记,物,轻链,螯合剂,Eu,重链,V,V,标记物为具有独特荧光特性的稀土金属-镧系元素,镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：,铕(Eu)、钐（,Sm)、镝(Dy)、锝(Te),镧系元素荧光特点：,荧光寿命极长,镧系元素螯合物,（60900 us),普通荧光免疫中荧光团：1100us,样本中蛋白质荧光：110us，易猝灭Stokes位移大（大约290nm）,铕：发射光613,nm、激发光340nm，,荧光素的,Stokes,位移为28,nm,荧光特异性强发射光谱带很窄：615 5nm）,解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0,时间分辨荧光免疫原理图,利用镧系元素,光谱,特点，将发射,荧光,与激发荧光,分辨,开来，零本底的又一保障,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。

可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离DELFIA技术为临床检测带来的先进性,技术,特点,检验先进性,时间分辨,光谱分辨,特异性荧光与非特异性荧光分离,发射荧光与激发荧光分离,零背景、高特异性,解离-增强,荧光性大大提高,稳定的荧光螯合物,线性范围更宽,重复性更好,原子标记,标记位点多，可达20个,对标记物结构及活性影响小,无衰变,受环境影响小,高稳定性，高精确度,试剂保质期至少一年,标准曲线保留时间长,同一批次只需两点定标,多标记,单，双，三，四标记,同一试剂盒可同时测多个项目,灵敏度更高，检测范围更广,以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书,试剂DELFIA Immulite ACS-180,AFP0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml,CEA0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml,HCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L,TSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml,FSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml,Prog0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml,Prolactin0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml,时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，,同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标,0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500,U/L,5,100,2000,Cps.10,3,DELFIA hFSH,N=6,标准曲线稳定，试剂保质期时间长,放射性免疫分析法（RIA）,应用,放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。

夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础缺点,放射性（,125,I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）,125,I 的半衰期短而导致其试剂有效期短标记物,125,I 的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费操作繁琐，出报告时间长无法保存备用酶免疫分析法（ELISA）,应用,酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害试剂有效期较长衍生技术：,荧光酶免疫分析,增强化学发光酶免疫技术,曾经一度被认为是取代放免的检测手段缺点,灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响,，导致稳定性不好化学发光免疫分析法（CLIA）,应 用,单个样本检测速度快，适合做急诊灵敏度较高自动化程度高分类：,以丫啶酯直接标记ACS180系统,以HRP标记，鲁米诺为发光底物Amerlite系统,以AP为标记物，AMPPD为发光底物Immulite系统,缺 点,发光过程短，样品不能重复检测本底较高，易受环境物质干扰仪器故障率较高试剂稳定性较差，需多次定标检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。

非开放性试剂；试剂价格高电化学发光免疫分析法（ECL）,应用,80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽缺点,非开放性试剂系统、不能做科研试剂价格过高时间分辨荧光免疫的试剂种类,内分泌科检查,甲状腺系列：TSH，Ultra TSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG,糖尿病系列：Insulin，C-Peptie,生长激素类：hGH,其他：Cortisol,妇产科检查,FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG,肿瘤科检查,AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211*,遗传科检查,产前筛查：hAFP/,HCG，PAPPA,新生儿筛查：Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU,核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCR检测肝炎系列,甲肝，乙肝，丙肝,血液科检测,贫血检查：Ferritin，Vit B12，Folic acid,白血病：免疫细胞分型等,细胞学检查,细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目,酶类检测及细胞受体检测（包括MHC，HLA等多种检测）,科研工具,单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测,时间分辨荧光免疫-突出优点,零本底、灵敏度高,线性范围宽,试剂有效期长,标准曲线稳定性好,易于自动化,TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命,。

时间分辨荧光,与,化学发光,方法学比较,时间分辨荧光,化学发光,发光效率95%1%,重复检测可无数次不可重复,本底噪声零本底干扰大,灵敏级数 10-1810-15,标记物原子大分子化合物,标记位点可达20个/抗体1个/抗体,标准曲线稳定达一年以上稳定 2 到 4周,多标记有，最多可达四标记无,科研开发有无,时间分辨荧光和电化学发光的比较,时间分辨荧光,电化学发光,标记物四种原子:Eu,Sm,Te,Dy一种原子:钌,多标记技术有无,做科研能(1000多种科研项目)无,试剂种类58种临床,24种科研,共82种28种临床,无科研试剂,试剂价格 低高,泰莱,I时间分辨荧光免疫分析系统,泰莱,I时间分辨荧光免疫分析系统,高灵敏度,10,-17,mol/孔(Eu,3+,),线形范围宽,10,-13,mol/孔10,-19,mol/孔,快速测试,1秒/一个样品,测试灵活,可以测试任意1-96个孔，样品摆放位置不受限制,标本量灵活,随机配置泰莱I全中文测试分析软件,界面简明友好，随意进行项目的选择和参数筛选,谢谢各位光临！,敬请各位指出不足并多提建议,。