蛋白质组学与分析技术第三讲课件.ppt

蛋白质组学与分析技术 邱德文2010241蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料2利用溶解度差别的纯化方法 1.1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜3蛋白沉淀步骤蛋白沉淀步骤·硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀·TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA 10%-20%，蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀去除TCA·丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除·在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重悬裂解样品溶液·用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗4聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳·通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构·等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质5聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳·通过丙烯酰胺单体和N，N，-甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构·等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，SDS-PAGE按相对分子质量大小分离蛋白质67等电聚焦电泳等电聚焦电泳8双向电泳双向电泳9胶上蛋白的检测胶上蛋白的检测·蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色·银染·负染·荧光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平10层析分离纯化技术层析分离纯化技术11蛋白质层析分离纯化技术蛋白质层析分离纯化技术·蛋白质薄层层析（硅胶板蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸）层析缸）·蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料）蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料）·蛋白质分析制备仪蛋白质分析制备仪121314151617181920层析分离技术层析分离技术(chromatography) · 层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，它是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。

· 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法21凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) ·凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化 三种不同的蛋白质根据它们大小的不同在层析柱中被分离 22亲和层析亲和层析(affinity chromatography) ·在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的， 改变条件可以使这种结合解除生物分子间的这种结合能力称为亲和力 琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素)23离子交换层析离子交换层析(ion-exchange chromatography) ·离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法 .通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白24柱层析分离柱层析分离 · 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。

我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱柱子可以分为：加压，常压，减压 · 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长.· 减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发，以前曾经大量的过 减压柱，但是自从尝试了加压后，就很少使用减压柱色谱了25蛋白质分析制备仪26选择纯化设备选择纯化设备纯化需要纯化需要MicroSpin™Syringe + ÄKTA™ 系统系统 +PurificationHiTrap™ HiTrap Modulescolumnscolumns快速，高处理量筛选(GST or (His)6 融合蛋白)非常快速，一步纯化   (适合大部分融合蛋白)一步纯化  (适合大部分融合蛋白)优化以提高纯度 常规实验，重复性好 纯化后蛋白复性 27HiTrap™ Chelating准备柱子 用 H2O 洗加 NiSO4 再用 H2O 洗加样用平衡缓冲液冲洗柱子废液收集用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白收集组份3 min5-15 min2 min用平衡缓冲液平衡柱子废液3 min28高效纯化策略高效纯化策略载量载量速度速度分辩率分辩率回收率回收率29准备工作准备工作 考虑考虑:·纯度水平纯度水平·需要量需要量·保持生物活性保持生物活性·有效和经济有效和经济 蛋白质特性蛋白质特性:·稳定性稳定性- pH- 离子强度离子强度- 温度温度·分子量分子量·等电点等电点30pH 的重要性的重要性: 蛋白质净电荷随蛋白质净电荷随 pH 改变改变滴定曲线蛋白质净电荷蛋白质净电荷 1210稳定性范围用阳离子交换用阳离子交换用阴离子交换用阴离子交换3pH不同 pH 下的分离情况21+-31pH 的重要性的重要性: 蛋白质净电荷随蛋白质净电荷随 pH 改变改变流动相的流动相的 pH 选择性选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷Abs Abs Abs Abs32样品准备样品准备考虑考虑:·根据蛋白质来源选择不同萃取方法根据蛋白质来源选择不同萃取方法·使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶·在室温以下快速处理在室温以下快速处理·用缓冲液维持用缓冲液维持 pH, 离子强度离子强度目的目的: 稳定样品稳定样品33三步纯化策略三步纯化策略Step 纯度粗提粗提 中度纯化中度纯化 精细纯化精细纯化 样品准备样品准备,萃取萃取,净化净化 达到最高纯度达到最高纯度去除大部分杂质去除大部分杂质 分离分离, 浓缩浓缩和稳定样品和稳定样品34三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤粗提粗提粗提粗提精细纯化精细纯化精细纯化精细纯化层析填料的层析填料的颗粒大小颗粒大小中度纯化中度纯化中度纯化中度纯化35三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤粗提粗提粗提粗提精细纯化精细纯化精细纯化精细纯化流速流速中度纯化中度纯化中度纯化中度纯化36三步纯化策略三步纯化策略步骤步骤粗提粗提粗提粗提精细纯化精细纯化精细纯化精细纯化分辩率分辩率中度纯化中度纯化中度纯化中度纯化37粗提粗提目的目的·纯化粗样纯化粗样·快速浓缩快速浓缩 (减少体积减少体积) 和稳定样品和稳定样品 (去除蛋白去除蛋白酶酶)最适用层析技术最适用层析技术: 离子交换离子交换 / 疏水层析疏水层析分辩率快速快速回收率载量载量38粗提粗提: 离子交换填料离子交换填料预装柱预装柱 20ml颗粒大小颗粒大小流速流速HiPrep™ 16/10 Q XL & SP XL 90 µm 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE & CM 90 µm 10 ml/minSepharose™ Big BeadsSTREAMLINE™Sepharose™ Fast Flow39粗提粗提: 疏水层析填料疏水层析填料·高载量高载量·高流速高流速HiPrep™ 16/10 Phenyl (高 & 低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrap™HIC 选择试剂盒放大40中度纯化中度纯化目的目的 ·去除大部分杂质去除大部分杂质最适用层析技术最适用层析技术: 离子交换离子交换 / 疏水层析疏水层析HiLoad™离子交换和疏水层析预装柱分辩率分辩率快速回收率载量载量41中度纯化中度纯化: 离子交换填料离子交换填料Sepharose™ HP 34 µmQ & SP<150 cm/hr小包装和预装柱小包装和预装柱 交联琼脂醣交联琼脂醣SOURCE™ 30 µmSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q & S<1 800 cm/hr聚苯乙烯聚苯乙烯/二乙烯基苯二乙烯基苯小包装小包装42中度纯化中度纯化:疏水层析填料疏水层析填料Sepharose™ HP 34 µm苯基苯基300 cm/hr小包装和预装柱小包装和预装柱43回收率载量载量精细纯化精细纯化目的目的·达到最终纯度达到最终纯度 (去除聚合物去除聚合物,结构变异物结构变异物) 最适用层析技术最适用层析技术: 凝焦过滤凝焦过滤/离子交换离子交换 / 疏疏水层析水层析/反相层析反相层析分辩率分辩率速度44精细纯化精细纯化: 凝胶过滤填料凝胶过滤填料Superdex™ Superdex™ PeptidePeptideSuperdex Superdex 200200Superdex Superdex 7575Mr 3 000 - 70 000Mr 100 - 7 000 Mr 10 000 - 600 000分离分子量大小 (球状蛋白质)102 103 104 105 106用用 prep grade (34 µm) 放大放大HR 预装柱预装柱 (13 µm)45精细纯化精细纯化: 凝胶过滤填料凝胶过滤填料Superdex™ Superdex™ 30 pg30 pgSuperdex Superdex 200 pg200 pgSuperdex Superdex 7575分离分子量大小 (球状蛋白质)102 103 104 105 106Prep Grade (34 µm)有有HiLoad™ 预装柱和小包装填料预装柱和小包装填料Mr 100 - 7 000 Mr 3 000 - 70 000Mr 10 000 - 600 00046精细纯化精细纯化:离子交换填料离子交换填料Mono™ Beads Q & S10 µm: Mono Q & S> 25 mg 上样载量上样载量3 µm: Mini Q & SMini™ Beads Q & S< 2 mg上样载量上样载量47精细纯化精细纯化:离子交换和疏水层析填料离子交换和疏水层析填料RESOURCE™15 µmQ, S, Phenyl, Ether, Isopropyl1 ml 预装柱流速高达预装柱流速高达10 ml/min RESOURCE HIC Test Kit48精细纯化精细纯化:反相层析填料反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™ RPC硅胶硅胶3 µmC2/C18聚苯乙烯聚苯乙烯/二乙烯基苯二乙烯基苯120 Å: 肽类肽类C4, C8, C185 and 12 µm硅胶硅胶100 Å: 肽类肽类300 Å : 蛋白质蛋白质pH 1 - 12 (14)肽类肽类5, 15 and 30 µm49Source™30 µm15 µm5 µm离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析50适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术蛋白质性质蛋白质性质层析技术层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC), 反相层析(RPC)生物辩识 (配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷, 扩张柱床吸附技术 (EBA) 疏水性有AC, IEX or HIC51适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术层析技术层析技术主要特色主要特色粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化IEX高分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率52适用於三步纯化策略的层析技术适用於三步纯化策略的层析技术层析技术层析技术样品起始状态样品起始状态样品结束状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度或 pH 改变样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液 (<5% 总柱体积)流速受限制样品被稀释样品被稀释RPC需要有机溶剂在有机溶剂中，或会损失生物活性样品体积不受限制53纯化工艺中不同层析技术的衔接纯化工艺中不同层析技术的衔接一般准则一般准则:·结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不结合互补选择性的技术，纯化工艺应尽量采用不同层析技术同层析技术(e.g. IEX, HIC and GF)·减少不同层析技术间的样品处理减少不同层析技术间的样品处理(e.g. 浓缩浓缩, 交交换缓冲液换缓冲液)·尽量简单尽量简单54衔接层析技术时注意事项衔接层析技术时注意事项层析技术层析技术结束情况结束情况起始条件起始条件小量样品GFGF低离子强度IEXIEX高离子强度或pH 改变高离子强度HICHIC低离子强度特异性结合条件ACAC特异性洗脱条件样品稀释交换缓冲液 (如果需要) 55合理衔接不同层析技术合理衔接不同层析技术低溶解度的蛋白质低溶解度的蛋白质SDS萃取萃取SDS萃取萃取溶解试剂溶解试剂(尿素, 乙二醇非离子性清洁剂)GF(在非离子性清洁剂中) HIC HIC GF GF56合理衔接不同层析技术合理衔接不同层析技术粗粗样或样品含高盐样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXIEXHICGF或或RPCGF或或RPCGFGF样品澄清样品澄清粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化57合理衔接不同层析技术合理衔接不同层析技术样品非常澄清或很稀样品非常澄清或很稀 ACIEXIEX沉淀沉淀(e.g. 在高离子强度下)HIC重新溶解重新溶解GF作含高盐样品处理作含高盐样品处理粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化GF或或RPCGF或或RPC58一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定一种不稳定，氧气敏感酶的纯化，结晶和三维结构测定Purification of a labile, oxygen-sensitive enzyme for crystallization and 3D structure determination一个可溶性，非融合蛋白质的一个可溶性，非融合蛋白质的多维纯化多维纯化去乙酰氧化头孢菌素去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶合成酶Deacetoxycephalosporin C synthase (DAOCS)Rama Bhikhabhai and Helena Hedlund, Amersham Pharmacia Biotech联合合作联合合作 Matthew Lloyd and Christopher Schofield, Oxford Centre for Molecular Sciences, Oxford, UKInger Andersson, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Sweden59DAOCS去乙酰氧化头孢菌素 C 合成酶D-AA = d-(D-a-aminoadipoyl)主要参与在头孢菌素和来自链丝菌主要参与在头孢菌素和来自链丝菌 clavuligerus 中青霉素中青霉素 N 的头霉菌的头霉菌素的生物合成素的生物合成属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶属于非红血素类亚铁依赖性的氧化酶青霉素 NDAOCSRing expansion去乙酰氧化头孢菌素去乙酰氧化头孢菌素 C60DAOCS - 纯化策略纯化策略纯化目标DAOCS·定性准备样品精细纯化精细纯化粗提粗提快速探索填料 (scouting)快速探索梯度 (scouting)中度纯化中度纯化快速探索填料 (scouting)快速探索梯度 (scouting)61DAOCS - 纯化纯化目标目标·得到 5-10 mg DAOCS，纯度足够进行结晶和 X-射线绕射分析·在一个工作天内完成整个纯化流程·工艺可放大最少 10 倍. 62结晶纯需要结晶纯需要·大分子均一性- 其他, 污染性蛋白质·序列均一性- 蛋白水解片段- 转译后修饰 - 其他修饰 (氧化等)·构象均一性- 聚合- 失活要拿到高纯度结晶，必须 使用纯和均匀的蛋白质63DAOCS - 定性定性参数参数等电点分子量盐稳定性一般稳定性 对纯化设计的影响对纯化设计的影响在粗提时使用中性 pH 进行阴离子交换层析用 Superdex™ 75 prep grade 凝胶过滤技术进行精细纯化可以使用疏水层析在缓冲液中加 DTT 工艺设计重点缩短整体纯化时间数值数值4.834 500>2 M (NH4)2SO4容易氧化64DAOCS - 一般准则一般准则·在所有缓冲液中加在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸使所有半胱氨酸残基保持还原状态残基保持还原状态·加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性·用用 SDS PAGE 检查每一个组份中检查每一个组份中 DAOCS·利用酶测定法测量生物活性利用酶测定法测量生物活性65准备样品准备样品悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中悬浮细菌细胞在溶解缓冲液中超声震荡破碎细胞超声震荡破碎细胞DNA 沉淀沉淀利用离心沉淀利用离心沉淀来源:从 S. Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增66选择粗提的层析技术选择粗提的层析技术·阴离子交换阴离子交换: 快速快速, 浓缩浓缩·样品处理最简单样品处理最简单·分离基础分离基础: 电荷电荷·因为因为 DACOS 的的酸性酸性 pI 和不稳定性，和不稳定性，所以缓冲液选择中性所以缓冲液选择中性 pH67粗提粗提 - 在在 ÄKTA™FPLC 上优化梯度上优化梯度线性梯度线性梯度步级梯度步级梯度优化梯度优化梯度层析柱层析柱:HiPrep™ 16/10 Q XL系统系统:ÄKTAFPLC0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min68选择中度纯化技术选择中度纯化技术·HIC: 分离基础分离基础: 疏水性疏水性·蛋白质疏水性质很难预测蛋白质疏水性质很难预测: 筛选适合填料筛选适合填料·HIC 可以跟可以跟 IEX 互补衔接互补衔接, 减少样品处理步骤减少样品处理步骤 (只只需要加盐需要加盐)·DAOCS 在高盐下能保持稳定在高盐下能保持稳定69选择精细纯化的层析技术选择精细纯化的层析技术·GF:分离基础分离基础: 分子量差异分子量差异 ·GF: 最适合分离双体，寡聚体和聚合最适合分离双体，寡聚体和聚合物物70DAOCS - 优化好的粗提步骤优化好的粗提步骤层析柱层析柱:HiPrep™ 16/10 Q XL系统系统:ÄKTA™FPLC•浓缩样品浓缩样品•快速去除有害物质快速去除有害物质01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm71DAOCS -优化好的中度纯化步骤优化好的中度纯化步骤层析柱层析柱: SOURCE™ 15ISO内径内径 16 mm, 长度长度 50 mm系统系统:ÄKTA™FPLC•HIC 和和 IEX 互补互补•浓缩样品浓缩样品•除去大部分杂质除去大部分杂质01002001002003004000mlA280 nm72DAOCS -优化好的精细纯化步骤优化好的精细纯化步骤层析柱层析柱: HiLoad™ 16/60 Superdex™ 75 prep grade系统系统: ÄKTA™FPLC•去除聚合物和余下的去除聚合物和余下的少量污染物少量污染物•交换缓冲液交换缓冲液08060402010020040060080010000mlmAU73DAOCS - 用用 SDS-PAGE 分析分析4321MMM -LMW 低分子量标记1 -样品2 -组份 - Q Sepharose™ XL3 -组份- SOURCE™ 15ISO4 -组份- Superdex™ 75 pg67k43k30k74DAOCS 纯化纯化 - 结果结果粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化08060402010020040060080010000mlmAU01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01002001002003004000mlmAu75DAOCS 纯化纯化 - 结果结果DAOCS 的高分辨电子密度图谱结晶 DAOCS 的 X-射线绕射图感谢瑞典农业科技大学的 Prof. Inger Andersson 和 Dr. Anke Terwisscha van Scheltinga, 以及瑞典 Uppsala 大学生化系的 Dr. Karin Valegård 提供以上图片76中度纯化中度纯化DAOCS 纯化纯化 - 总结总结工艺工艺优化优化快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)快速探索填料(scouting)快速探索梯度(scouting)优化好的纯化流程优化好的纯化流程样品准备样品准备HiPrep™ 16/10 Q XLSOURCE™ 15ISOHiLoad™ 16/60 Superdex™ 75 prep grade 粗提粗提精细纯化精细纯化浓缩浓缩60 分钟分钟30分钟分钟40分钟分钟120分钟分钟80分钟分钟时间时间浓缩浓缩77ÄKTA™ 平台层析系统纯化平台层析系统纯化 DAOCS - 结论结论·DAOCS 纯度足够进行结晶纯度足够进行结晶·使用使用 ÄKTA 平台层析系统的模板和快速探索平台层析系统的模板和快速探索 (scouting) 功能可以快捷有效地优化纯化工艺功能可以快捷有效地优化纯化工艺·纯化时间从纯化时间从 3 天减少到天减少到 6 小时小时78请参考中文网站79。