【最新word论文】131I1H12的制备及对非小细胞肺癌细胞A549的结合及生物学效应研究【临床医学专业论文】.doc

1131I1H12 的制备及对非小细胞肺癌细胞 A549 的结合及生物学效应研究作者：殷宁，杜明华，钟英，曲海船【摘要】 目的: 研究放射性核素碘(131I)标记表皮生长因子受体单克隆抗体(McAb)1H12 的实验条件，观察标记产物 131I1H12 与人肺癌细胞 A549的免疫结合及生物学效应方法:131I 以 Iodogen法标记 1H12，经体外细胞结合试验分析检测标记抗体的免疫活性;通过流式细胞仪检测不同剂量131I1H12(148 、74、37 kBq)、游离 131I(148 kBq)及 1H12(80 nmol·ml-1)对 A549细胞的作用结果:131I1H12 标记率为 50.14%，比活度为 4.63 MBq·μg-1,放射性浓度为 77.31 MBq·ml-1，放射性化学纯度为96.92%131I1H12 与 A549细胞结合率为 61.12%;131I1H12 诱导 A549细胞凋亡和周期阻滞呈剂量 效应关系，以 148 kBq131I1H12 作用效应最大，凋亡率达到(44.35±3.31)%，G2/M 期细胞阻滞率达(51.17±2.98)%。

结论:131I1H12 能够与 A549细胞发生免疫结合，并调控细胞周期和诱导细胞凋亡 【关键词】 非小细胞肺癌; 表皮生长因子; 放射免疫治疗; 131I; 单克隆抗体[Abstract] Objective: To investigate the experimental conditions of radionuclide iodine(131I) labeling epidermal growth factor receptor(EGFR) monoclonal antibody(McAb) 1H12, observe the cellbinding function and biological effects of 131I1H12 to human lung cancer cells A549. Methods: 1H12 was labeled with 131I by Iodogen method. The immunocompetence of 131I1H12 was analyzed by cellbinding test. The cell apoptosis and cell cycles of A549 were analyzed by flow cytometry assay with various doses of 131I1H12(148, 74, 37 kBq), free131I (148 kBq), 1H12(80 nmol·ml-1)and equivalent medium. Results: The labeling rate of 131I1H12 was 50.14%, its specific activity, radioactive concentration and radiochemical purity were 4.63 MBq·μg-1, 77.31 MBq·ml-1 and 96.92% respectively. The specific binding rate of 131I1H12 to A549 cells was 61.12%; The apoptosis rate and cycle blockage rate of A549 cells induced by 131I1H12 were in a doseeffect relationship; The supreme apoptosis rate[(44.35±3.31)%] and G2/M cell cycle blockage rate[(51.17±2.98)%] were found in the A549 cells treated with 148 kBq 131I1H12. Conclusion: 131I1H12 can immunobind with A549 cells and regulate cell cycle and induce apoptosis of A549 cells to inhibit its proliferation; It might have some potential application prospect in biological targeted diagnosis and therapeutics.2[Key words] nonsmall cell lung cancer; epidermal growth factor; radioimmunotherapy; 131I; monoclonal antibody表皮生长因子受体(EGFR)在非小细胞肺癌的治疗中已成为一个重要的靶点，目前针对 EGFR的肺癌靶向治疗药物(易瑞沙、特洛凯等)早已进入临床应用[1-2]。

为研究应用抗 EGFR抗体进行非小细胞肺癌放射免疫显像及治疗的可能性，本实验通过放射性碘标记 EGFR单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)1H12，探讨了 131I1H12 与人肺癌细胞 A549在体外结合情况及其生物学效应1 材料与方法1.1 A549细胞人非小细胞肺癌 A549细胞系 22代，购于中国科学院上海细胞生物研究所1.2 主要仪器FH463A自动定标器(西安二六二厂核仪器分厂);RM905a 活度计(中国计量科学研究所); HERA Cell CO2 培养箱(美国 Kendro公司);Eppendorf cenhifuge低温冷冻离心机(德国 Eppendorf公司);YJ875 超净工作台(苏州苏净净化设备有限公司);流式细胞仪：FACS Vantage SE 型1.3 主要试剂鼠抗人 EGFR McAb(1H12)：美国 CST公司产品，纯度>98%Na131I 溶液:中国核动设计院第一研究所(无还原剂、无载体)产品Iodogen(四氯二苯基甘脲)：美国 Sigma公司产品葡聚糖凝胶 G50(SephadexG50): 瑞典 Amersham Biosciences公司产品。

细胞培养液 RPMI 1640培养液: Gibcobrl 公司产品胎牛血清(FCS):杭州四季青生物工程材料有限公司产品1.4 131I1H12 的标记与鉴定[3](1) 标记前准备：将 Iodogen溶解于二氯甲烷中制成浓度为 1 μg·μl-1的 Iodogen溶液，取 100 μl 加入乙烯 Eppendorf管中，氮气吹干后在试管底部内壁形成一层均匀的 Iodogen膜，制备完成后保存于 4 ℃备用2)Iodogen 法131I标记 1H12：在涂布 Iodogen的 Eppendorf管中依次加入 0.5 mol·L-1、pH 7.6的磷酸盐缓冲液 50 μl，1H12 25.0 μg(pH 7.6 PBS溶解，浓度 1 μg·μl-1), Na131I 46.25 MBq，充分混匀后在室温下反应 10 min，其间温和振荡数次3) 分离纯化反应：将反应液滴加于预先经 PBS(0.01 mol·L-1、pH 7.4)平衡、2%牛血清白蛋白封闭饱和的 SephadexG50 层析柱上，用 0.01 mol·L-1、pH 7.4的 PBS洗脱层析柱，自动收集器收集部分洗脱液,流速每管1.0 ml·min-1，共收集 20管，按收集时间顺序排列各管;RM905 放射性活度计测定各管的活度，以 Rf为横坐标，对应各管的放射性活度为纵坐标，制作时间 放射性活度洗脱曲线。

4) 放射化学纯度(radio chemical purity，RCP)测定:生3理盐水纸层析法测定标记物 RCP5) 计算标记率、放射浓度：标记率=蛋白峰各管放射性活度总和/蛋白峰加游离峰各管放射性活度之和;放射浓度=投入的Na131I总量×标记率/蛋白峰收集的总 ml数6) 比活度的测定：放射性比活度=投入的 Na131I总量×标记率/投入的 1H12量7) 131I1H12 的体外稳定性，置于室温 37 ℃，于第 24小时、48 小时、72 天测定各自放射化学纯度，评价其体外稳定性8) 131I1H12 收集液过滤除菌备用1.5 131I1H12 对 A549细胞株的体外实验(1) A549细胞 EGFR表达率：取对数生长期细胞，调整细胞浓度至 106 ml-1，用-20 ℃预冷的 80 ml·L-1乙醇固定过夜，流式细胞测定 EGFR的表达率2)131I1H12 免疫活性的鉴定：常规培养的肺癌细胞株(A549)、脐静脉血管内皮细胞,用 RPMI 1640完全培养液制备细胞悬液调至细胞浓度 1×106 ml-1，两种细胞分别装入 6孔培养板使细胞浓度在 1×106细胞·(1.0 ml)-1·孔-1(足量)，每组细胞中分别加入 131I1H12(105 cpm)，摇匀，常规培养 12 h，每 2 h振荡1次，培养 12 h后将每孔的上清液移入试管，0.25 ml胰蛋白酶消化 A549细胞与脐静脉血管内皮细胞，将细胞移入装有相应上清液的试管。

在 FH463A自动定标器上测定每孔的总放射性1 000 r·min-1离心 5 min，去上清液沉淀用PBS洗涤 3次，最后测沉淀物放射性按如下公式计算体外细胞结合率：体外细胞结合率(%)=沉淀部分放射性计数(cpm)/总放射性计数(cpm)×100%[4]3) 药物实验分组：将 24瓶对数生长期 A549细胞分成 A～F 6组，每组 4瓶，A、B、C 组分别加入 131I1H12 148、74、37 kBq，D 组加入 Na131I溶液 148 kBq，E 组加入 1H12 80 nmol·L-1，F 组加入等量培养液[5]4)检测131I1H12 对细胞的生物学作用：给药后的各组细胞用小铅砖分隔培养 12 h后换液(普通培养液)，继续分隔培养 36 h显微镜下观察细胞形态，收集细胞以调整浓度至 106 ml-1，用-20 ℃预冷的 80 ml·L-1乙醇固定过夜，并用以AnnexinⅤFIFC/PI 双染法测定药物对细胞的早期诱导凋亡作用，采用 DNA倍体分析法检测细胞周期[4,6]1.6 统计学处理数据用均数±标准差表示，SPSS 13.0软件处理，采用方差分析;两两比较采用 LSD法。

2 结 果2.1 EGFR McAb131I1H12 的标记及鉴定Iodogen法碘化标记 McAb(1H12)，经 SephadexG50 柱层析分离游离碘和EGFR McAb131I1H12 ，从洗脱曲线上(图 1)可见：131I1H12 蛋白峰出现在第3、4、5 管;游离碘峰出现在第 10、11、12 管标记产物进行纸层析，根据公式计算其标记率为 50.14%，比活度为 4.63 MBq·μg-1，其放射浓度为 77.31 MBq·ml-1，生理盐水纸层析法测定放射性化学纯度为 96.92%24、48、72 h 我们测得的放射性化学纯度依次为 95.33%、94.79%和 91.03%，说明标记产物在体4外具有较好稳定性2.2 标记抗体 131I1H12 的免疫活性标记抗体经体外细胞结合分析显示 131I1H12 与 A549细胞体外结合率达61.12%，而与人脐静脉血管内皮细胞不发生特异性体外结合，其结合率仅为7.16%，和前者比差异具有统计学意义(P<0.001)说明：(1) 1H12经 131I Iodogen法标记后保持有良好的免疫结合特性2) 131I1H12 与 A549细胞呈特异性结合。

2.3 131I1H12 对。