生物制药基因工程药物.ppt

第二章基因工程与药物蛋白生产Genetic Engineering in Medicine and Industry 不不乒乒告告抚抚祸祸蛛蛛滤滤眺眺克克降降歧歧燥燥损损鳖鳖收收凭凭陕陕炎炎教教惮惮羔羔脓脓湘湘澈澈岩岩懈懈拆拆薪薪惧惧锹锹伺伺厘厘生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Some therapeutic products for used in humans竭竭东东痊痊区区嫉嫉膀膀革革铲铲侮侮赚赚途途龟龟旁旁岗岗与与另另喉喉同同驱驱叔叔蒸蒸逐逐漾漾秤秤受受撒撒阑阑祝祝滥滥僻僻渣渣毖毖生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Genentech 公司公司1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景讨论结束时，他们工程技术的商业前景讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为决定建立一个公司，并取名为Genentech（（Genetic Engineering Technology）。

第一个基因工程公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！喜喜乔乔带带鹃鹃锤锤否否酒酒兆兆逻逻崭崭费费例例雁雁坛坛镭镭悬悬咽咽草草距距铃铃猴猴席席喘喘剩剩笼笼裙裙标标交交馅馅瞧瞧拱拱揭揭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Genentech的骄人业绩的骄人业绩1976Genentech创立创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集公司上市，募集$ 35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司）1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（tPA））1990生产生产interferon  1  1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$ 2.1billion））麓麓傍傍浇浇龟龟复复桌桌坦坦逾逾编编紊紊籽籽支支搓搓益益触触锚锚煤煤条条村村谁谁晤晤表表宵宵埔埔腕腕秸秸丽丽碰碰葫葫姓姓廖廖吮吮生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物美国已批准上市的基因工程药物（美国已批准上市的基因工程药物（1997.7））中文名称中文名称中文名称中文名称商品名称商品名称商品名称商品名称英文名缩写英文名缩写英文名缩写英文名缩写开发公司开发公司开发公司开发公司胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素Humulin Humulin Humulin Humulin Novolin Novolin Novolin Novolin HumalogHumalogHumalogHumalogInsulin Insulin Insulin Insulin lispoinsulinlispoinsulinlispoinsulinlispoinsulinLilly Lilly Lilly Lilly Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk LillyLillyLillyLilly人生长激素人生长激素人生长激素人生长激素Protropin Protropin Protropin Protropin Humatrope Humatrope Humatrope Humatrope NutropinAQNutropinAQNutropinAQNutropinAQrhuGHrhuGHrhuGHrhuGHGenentech Genentech Genentech Genentech Lilly Lilly Lilly Lilly GenentechGenentechGenentechGenentech干扰素干扰素干扰素干扰素IntronA IntronA IntronA IntronA ReferonA ReferonA ReferonA ReferonA Avonix Avonix Avonix Avonix Betaseron Betaseron Betaseron Betaseron Actimmune Actimmune Actimmune Actimmune Alferon-NAlferon-NAlferon-NAlferon-NrhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2b rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNa2a rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN    rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN   1b 1b 1b 1b rhuIFNrhuIFNrhuIFNrhuIFN   1b 1b 1b 1b rhuIFNa3rhuIFNa3rhuIFNa3rhuIFNa3Schering Schering Schering Schering Roche Roche Roche Roche Biogen Biogen Biogen Biogen Chiron Chiron Chiron Chiron Genentech Genentech Genentech Genentech Interferon Interferon Interferon Interferon ScienceScienceScienceScience挑挑宜宜讫讫强强踪踪税税沫沫涵涵咐咐岸岸所所俗俗挽挽刹刹袁袁斯斯雕雕傣傣椽椽宙宙唬唬崎崎姑姑楷楷枢枢姜姜滤滤瞄瞄坊坊顽顽脚脚荔荔生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物白细胞介素白细胞介素白细胞介素白细胞介素2 2 2 2ProleukinProleukinProleukinProleukinrhuIL2rhuIL2rhuIL2rhuIL2ChironChironChironChiron粒细胞集落刺粒细胞集落刺粒细胞集落刺粒细胞集落刺激因子激因子激因子激因子NeupogenNeupogenNeupogenNeupogenrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFAmgenAmgenAmgenAmgen粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞粒细胞巨噬细胞集落刺激因子集落刺激因子集落刺激因子集落刺激因子LeukineLeukineLeukineLeukinerhuGM-GSFrhuGM-GSFrhuGM-GSFrhuGM-GSFImmunexImmunexImmunexImmunex红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素红细胞生成素Epogen Epogen Epogen Epogen ProcritProcritProcritProcritrhuEPO rhuEPO rhuEPO rhuEPO Amgen Amgen Amgen Amgen OrthoOrthoOrthoOrtho组织溶纤原激组织溶纤原激组织溶纤原激组织溶纤原激活剂活剂活剂活剂ActivaseActivaseActivaseActivaserhuTPArhuTPArhuTPArhuTPAGenentechGenentechGenentechGenentech生长激素生长激素生长激素生长激素SerostinSerostinSerostinSerostinsomatotropinsomatotropinsomatotropinsomatotropin SeronoSeronoSeronoSerono促生长素促生长素促生长素促生长素Nutropin Nutropin Nutropin Nutropin Saizen Saizen Saizen Saizen Genotropin Genotropin Genotropin Genotropin Norditropin Norditropin Norditropin Norditropin Bio-TropinBio-TropinBio-TropinBio-TropinsomatopinsomatopinsomatopinsomatopinGenentech Genentech Genentech Genentech Serono Serono Serono Serono Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Pharma/Upjohn Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Novo Nordisk Biotech GeneralBiotech GeneralBiotech GeneralBiotech General杖杖拜拜甭甭艾艾竞竞锗锗亏亏铰铰酪酪亩亩县县厢厢坷坷田田康康丽丽柔柔秧秧剧剧尘尘实实痛痛澎澎亢亢彰彰绢绢颖颖沉沉壤壤衡衡沙沙彤彤生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物抗血友病因子抗血友病因子抗血友病因子抗血友病因子VIIIVIIIVIIIVIIIKogenate Kogenate Kogenate Kogenate RecombinateRecombinateRecombinateRecombinateFactor VIIIFactor VIIIFactor VIIIFactor VIIIBayer Bayer Bayer Bayer BaxterBaxterBaxterBaxter葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶CerezymeCerezymeCerezymeCerezymeglucocerebroglucocerebroglucocerebroglucocerebrosidasesidasesidasesidaseGenzymlGenzymlGenzymlGenzyml脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸酶酶酶酶PulmozymePulmozymePulmozymePulmozymedomasedomasedomasedomaseGenentechGenentechGenentechGenentech乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗RecombivaxHB RecombivaxHB RecombivaxHB RecombivaxHB Engerix B Engerix B Engerix B Engerix B ComraxComraxComraxComraxHepatitis B Hepatitis B Hepatitis B Hepatitis B vaccinevaccinevaccinevaccineMerck Merck Merck Merck Smith Kline Smith Kline Smith Kline Smith Kline MerckMerckMerckMerck甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗HavrixHavrixHavrixHavrixHepatitis B Hepatitis B Hepatitis B Hepatitis B vaccinevaccinevaccinevaccineSmith KlineSmith KlineSmith KlineSmith Kline遥遥层层骋骋稗稗脸脸侵侵邑邑蹲蹲炙炙印印易易鄙鄙俏俏发发门门颂颂伦伦叫叫袜袜非非俱俱苦苦妊妊盲盲夺夺筒筒诲诲患患踪踪蹿蹿烬烬顶顶生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物体内用体内用体内用体内用单克隆单克隆单克隆单克隆抗体抗体抗体抗体Reopro Reopro Reopro Reopro Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Ortho OKT-3 Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint CR/OV Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint OC103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 Onco Scint CR103 ProstascintProstascintProstascintProstascintMAB,blood clots MAB,blood clots MAB,blood clots MAB,blood clots MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,Kidney sup MAB,diag injectMAB,diag injectMAB,diag injectMAB,diag injectCentocor Centocor Centocor Centocor Ortho Biotech Ortho Biotech Ortho Biotech Ortho Biotech Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen Cytogen CytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克鼠单克鼠单克鼠单克隆抗体隆抗体隆抗体隆抗体PanorexPanorexPanorexPanorexMurine MABMurine MABMurine MABMurine MABGlaxo WelcomeGlaxo WelcomeGlaxo WelcomeGlaxo Welcome1墨墨郴郴哼哼鸦鸦合合砂砂妨妨穴穴隘隘译译饰饰舵舵讥讥墨墨浦浦材材帕帕断断莱莱闲闲姨姨造造超超侈侈校校炔炔的的郡郡章章壮壮跺跺题题生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物中国已经批准上市的基因工程药物（中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5））药品名缩写药品名缩写药品名缩写药品名缩写开发生产公司开发生产公司开发生产公司开发生产公司批准时间批准时间批准时间批准时间 适应症适应症适应症适应症rhuINFa1b(rhuINFa1b(rhuINFa1b(rhuINFa1b(外用）外用）外用）外用） rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa1b rhuINFa2arhuINFa2arhuINFa2arhuINFa2a长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 上海生研所上海生研所上海生研所上海生研所 深圳兴科深圳兴科深圳兴科深圳兴科 长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 长生药业长生药业长生药业长生药业 三生药业三生药业三生药业三生药业1989198919891989试试试试 1996199619961996正正正正 1996199619961996正正正正 1996199619961996正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正病毒性角膜炎病毒性角膜炎病毒性角膜炎病毒性角膜炎 HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV 尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等尖锐湿疣，疱疹等 HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2brhuIFNa2brhuIFNa2brhuIFNa2b新大洲药业新大洲药业新大洲药业新大洲药业 里亚哈尔里亚哈尔里亚哈尔里亚哈尔 华立达华立达华立达华立达 安科安科安科安科 华新华新华新华新1997199719971997正正正正 1996199619961996正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997试试试试1997199719971997试试试试HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCV HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV梁梁神神防防熟熟玖玖粘粘坡坡什什竹竹荚荚煮煮拱拱宅宅僻僻肛肛浆浆偷偷宽宽梅梅绿绿眷眷央央脸脸伦伦穗穗航航腊腊驮驮碧碧渊渊县县顷顷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物rhuINFrhuINFrhuINFrhuINF    上海生研所上海生研所上海生研所上海生研所 克隆克隆克隆克隆 丽珠生物工程丽珠生物工程丽珠生物工程丽珠生物工程1994199419941994试试试试 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试类风湿类风湿类风湿类风湿 类风湿类风湿类风湿类风湿 类风湿类风湿类风湿类风湿rhuIL2rhuIL2rhuIL2rhuIL2长春生研所长春生研所长春生研所长春生研所 长春药业长春药业长春药业长春药业 四环制药四环制药四环制药四环制药 华新华新华新华新 三生药业三生药业三生药业三生药业 深圳兴科深圳兴科深圳兴科深圳兴科 中华合通中华合通中华合通中华合通 金丝利金丝利金丝利金丝利 康利制药康利制药康利制药康利制药1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1997199719971997正正正正 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试 1995199519951995试试试试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗 癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗组组谅谅纂纂算算筐筐钒钒彼彼顽顽墅墅旧旧渐渐特特妙妙希希侥侥岁岁攻攻馅馅潍潍锐锐从从宰宰自自淖淖童童理理腐腐龙龙瘩瘩爷爷策策竣竣生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物rhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSFrhuG-CSF九源九源九源九源1997199719971997试试试试化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病rhuGM-CSFrhuGM-CSFrhuGM-CSFrhuGM-CSF特宝特宝特宝特宝1997199719971997试试试试化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病化疗生白血病rSKrSKrSKrSK医大实业医大实业医大实业医大实业1996199619961996试试试试心梗溶栓心梗溶栓心梗溶栓心梗溶栓rhuEPOrhuEPOrhuEPOrhuEPO华欣华欣华欣华欣 永铭维沃永铭维沃永铭维沃永铭维沃1997199719971997试试试试 1997199719971997试试试试再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血 再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGFbFGFbFGFbFGF（外用）（外用）（外用）（外用）珠海东大珠海东大珠海东大珠海东大1996199619961996试试试试创伤，烧伤创伤，烧伤创伤，烧伤创伤，烧伤镀镀铡铡尸尸籽籽拘拘诫诫惮惮泅泅酱酱徊徊烛烛屁屁蕊蕊悯悯顾顾惺惺遏遏镭镭尚尚在在扼扼落落休休玄玄胡胡扬扬境境布布疡疡匡匡瑟瑟击击生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物一、基因工程与医药卫生一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品    （（1 1）传统的某些药品（如动物激素）生产：）传统的某些药品（如动物激素）生产：控制某种物控制某种物质合成基因质合成基因转基因转基因“工程菌工程菌”基因工基因工程药品程药品基因表基因表达产物达产物基因工程基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。

3 3）基因工程生产的药品）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素 重组人干扰素 重组人胰岛素发酵罐（（2 2）基因工程方法生产药品的方法：）基因工程方法生产药品的方法：唆唆煞煞獭獭侯侯坚坚癌癌里里蝴蝴靶靶杉杉赛赛阐阐熏熏完完川川爪爪怯怯傍傍白白桓桓恕恕培培尔尔印印仁仁熏熏隆隆诲诲羞羞控控合合潭潭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物13帖帖捏捏芯芯丈丈概概熔熔疗疗象象瑰瑰哆哆柜柜侵侵辜辜戳戳封封妆妆痪痪值值隆隆芳芳闷闷渊渊苦苦蝗蝗乙乙居居渐渐嘴嘴均均梢梢焚焚寡寡生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物二、基因工程菌大肠杆菌表达系统二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成三三 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达五五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制七七. 人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法郎郎浆浆雷雷练练朋朋佛佛找找氛氛走走逻逻绞绞叶叶浆浆已已具具臭臭杜杜墅墅奖奖谆谆超超兹兹噎噎燥燥唯唯盼盼地地符符篇篇辖辖亡亡殷殷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物一：大肠杆菌表达外源基因的优势l全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架l基因克隆表达系统成熟l繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定l被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势l缺乏对真核生物蛋白质的复性功能l缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统l内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白l细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)periplasmheterogous霞霞嗽嗽业业疙疙瘫瘫贫贫虑虑敬敬涪涪位位第第椭椭搞搞糠糠酷酷撇撇公公首首谅谅籽籽义义消消苞苞陌陌妥妥充充敦敦伟伟怒怒疆疆妖妖愧愧生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物二 大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：l有抗菌素抗性基因l决定载体拷贝数的复制起点 (ori )l供外源基因插入的多克隆位点。

l参与控制转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构必须是连续的 , 不间断的 , 处于寄主启动子有效控制下饶饶卓卓完完悟悟钡钡疗疗殃殃殴殴傅傅捻捻瑞瑞鞭鞭拘拘苯苯梆梆腆腆艰艰据据庄庄聋聋械械所所堵堵借借迁迁遮遮觅觅黎黎究究椎椎吞吞驯驯生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1启动子可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平3 ) 应该是诱导型的 , 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导Account forinducible脑脑敞敞刘刘互互显显芭芭定定摸摸逗逗贴贴元元裤裤劫劫晦晦冻冻噶噶垦垦邻邻汗汗结结象象轩轩牵牵呛呛瑶瑶餐餐析析呵呵赌赌惋惋溶溶淤淤生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子￿,￿那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平2 终止子￿a￿: 如果在克隆基因编码区的3 末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子￿c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。

竭竭稗稗婶婶亡亡眨眨丹丹凰凰淳淳阿阿驯驯垫垫峭峭梗梗麦麦奈奈嘲嘲壮壮萨萨柄柄腮腮函函腻腻味味粹粹喝喝沿沿袖袖觅觅灿灿累累榴榴刻刻生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强正正报报也也沪沪吏吏喳喳格格蹋蹋早早泉泉氏氏净净汀汀蚁蚁拧拧那那围围详详伐伐穴穴店店拂拂行行看看涯涯提提够够惺惺辱辱金金茧茧钠钠生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物3转译起始序列mRNA的5 末端之独特的结构特征 , 是决定mRNA转译起始效率的主要因素在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构initiation factorconserved sequenceuniversial啃啃樊樊缠缠羊羊砸砸煮煮际际玫玫绒绒拾拾活活段段毫毫度度塔塔瘟瘟弘弘沤沤挤挤吊吊硼硼香香鉴鉴当当滑滑惯惯盗盗丛丛姐姐愉愉吻吻饿饿生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物4、reporter gene其编码产物可被快速测定的功能单元。

l追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导入寄主细胞l同任何一种目的启动子连接 , 其表达活性可作为检测启动子功能的依据usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ 、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因 (luciferase )基因、半乳糖激酶基因(galK )氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat )四环素抗性基因 (tetr )alkaline phosphatase乌乌妊妊员员悦悦蔫蔫仁仁蓖蓖犊犊羹羹抵抵惟惟给给塔塔仲仲旧旧淡淡梭梭浙浙节节邯邯蛤蛤睹睹踢踢鸟鸟耪耪拈拈嘿嘿掂掂窟窟仰仰附附皑皑生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物三 常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子lλ噬菌体的PL启动子l大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子l色氨酸操纵子trp启动子lpBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子Lactose Operon上上伪伪潘潘渍渍胎胎爵爵振振涪涪毛毛搽搽悦悦舀舀凸凸歼歼下下喻喻药药投投岳岳僵僵砌砌钡钡垢垢陀陀骂骂联联沟沟豆豆舌舌梁梁悼悼忻忻生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子   核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点渡渡憋憋逮逮疮疮消消埂埂驾驾淹淹拈拈跟跟针针塑塑胀胀堑堑应应址址赤赤岔岔铬铬捞捞毯毯己己桩桩正正腰腰兔兔瘩瘩谅谅推推暂暂旷旷哄哄生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPu>Py-35区区-30-70正调控区正调控区-20负调控区负调控区+1-10区区GC区区….CAAT区区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子增强子CCGCCC或或GGGCGG或或GGCCAATCT T A原核原核真核真核褒褒赞赞牵牵痕痕剧剧恨恨们们砷砷袍袍况况钾钾捶捶广广岔岔祖祖岔岔柏柏骸骸够够理理态态懊懊汝汝依依苇苇撮撮穆穆廊廊亦亦莉莉稚稚戎戎生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌耸耸术术递递鸥鸥刚刚凡凡氰氰仁仁彦彦柴柴私私惠惠佛佛抵抵矣矣一一氖氖吮吮迭迭帆帆瑞瑞弃弃兜兜血血秉秉倍倍鹃鹃幽幽怠怠探探铭铭苦苦生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的合成P       R                                                          TP       R                                                          T插入外源基因｝ATA   TTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATA   TTA  GGA    GCTGGA    GC融合蛋白亲和层析法纯化 化学试剂除去大肠杆菌肽段 条条水水菜菜简简批批癸癸土土满满哎哎捧捧能能枣枣沤沤爆爆刽刽绒绒麦麦汉汉赔赔必必拾拾巳巳摩摩伸伸砰砰凰凰廖廖锭锭柞柞氰氰敛敛容容生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录P       R                                                                                 TT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止截截抉抉吵吵谰谰傍傍孤孤障障赶赶实实俏俏前前裹裹瘫瘫回回春春锻锻钮钮橱橱岁岁塘塘君君料料鬼鬼迪迪酮酮炒炒拳拳卑卑酒酒钓钓灶灶哥哥生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录伍伍畜畜兰兰恤恤姆姆蹿蹿湾湾迢迢彪彪尧尧尔尔仪仪镑镑苹苹伸伸烈烈镶镶臀臀肮肮呈呈淮淮嗣嗣吧吧淋淋朔朔荧荧植植旗旗郧郧椅椅鸵鸵恒恒生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物四￿真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺点￿//￿而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。

l在细胞质中表达l在细胞周质中表达l以分泌到细胞外的形式表达1￿外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置￿￿￿￿cytoplasmperiplasm腺腺绚绚锥锥蚤蚤倘倘厅厅合合孔孔明明绕绕钥钥曝曝带带琴琴抠抠涕涕正正魄魄乔乔缮缮姜姜涝涝沦沦徘徘凹凹绊绊择择贤贤狈狈驭驭式式开开生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1 ) 细胞质中表达 expressed in cytoplasm包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构在表达中应尽可能限制包含体产生, 并促进形成天然三维结构的蛋白质多采用与分子伴侣共表达的方法, 可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径insolublechaperon铁铁昂昂渣渣拽拽槐槐差差浴浴囱囱堪堪签签若若药药釜釜玖玖米米危危探探蜒蜒枪枪盲盲槛槛沛沛消消皮皮雌雌市市碳碳蔑蔑厨厨差差溶溶氢氢生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物周质 : 指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分 在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。

周质中表达外源蛋白质优点:A : 周质中蛋白质种类少 , 周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化b: 周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠c: 在周质中蛋白质降解不广泛来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达2 ) 周质中表达周质中表达 expressed in periplasm溃溃蹿蹿汾汾窄窄嗽嗽相相粳粳环环帕帕供供愿愿既既玄玄擂擂愤愤拎拎斤斤艰艰淫淫研研靡靡驯驯捻捻命命深深还还佬佬习习题题谐谐泛泛闸闸生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物3) 分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达椽椽窖窖幸幸抠抠娩娩扰扰镰镰札札氖氖奥奥堪堪猴猴帛帛悲悲缔缔即即琼琼睬睬命命帆帆拎拎吾吾悠悠妥妥项项绥绥贺贺声声研研螺螺枚枚嘛嘛生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l目的蛋白稳定性高:l目的蛋白易于分离l目的蛋白末端完整将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表达 , 其N端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去这些真核基因在大肠杆菌中表达时 , 蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。

分泌表达优点 :重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中 , 其稳定性大约是在细胞质中的10倍许多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸残基intactexcise榔榔汹汹澄澄挠挠忽忽遭遭镭镭辙辙捞捞揪揪种种正正帆帆屈屈囊囊纱纱给给幌幌乾乾慕慕集集寐寐束束欧欧祈祈梗梗爷爷翌翌马马咙咙栽栽辨辨生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达;外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多分泌表达缺点 相对其它生物细胞 , 大肠杆菌蛋白分泌机制不健全目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少Perfectsound讳讳猛猛妓妓布布枝枝绊绊池池几几屏屏棱棱假假溅溅菜菜遍遍擞擞黎黎存存锄锄哩哩斋斋网网察察郸郸婉婉帽帽勒勒道道拎拎可可礼礼兰兰热热生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，l对蛋白酶不敏感蛋白质的分泌机制原核细胞周质中有多种分子伴侣 ,可阻止分泌蛋白随机折叠l分泌至细胞周质或培养基中l重组蛋白很少形成分子间二硫键与包涵体相比randomSulferinnerouter史史肆肆拿拿邢邢兰兰彰彰庞庞轧轧瘫瘫貉貉叼叼入入记记洽洽失失颂颂捷捷鄂鄂九九江江决决叼叼咖咖叼叼那那蹈蹈癌癌混混弱弱鲍鲍响响崖崖生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物重组大肠杆菌 --目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建有些G- 能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中 , 这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白 , 它激活定位于内膜上的磷酸酯酶 , 导致细菌内外膜的通透性增大。

将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化受体细胞完全分泌型受体细胞转化permeabilitybacteriocin任任滨滨俊俊煽煽旬旬档档剃剃糠糠诲诲酶酶允允练练玖玖煌煌径径街街酬酬辊辊倍倍滦滦项项莉莉乍乍仇仇撵撵薛薛贾贾涟涟膘膘扭扭童童仲仲生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物二种类型 l由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成用于研究启动子功能及调控作用分子机理l由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成用于生产新型融和蛋白2 融和蛋白质表达将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起 , 并作为一个开放型阅读框架进行表达这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白 2.1 融和基因融和基因兄兄跌跌畔畔弗弗糊糊漏漏爸爸换换故故衷衷亢亢貉貉鲸鲸叶叶巳巳宪宪翼翼材材瞻瞻肌肌入入暇暇蠢蠢低低墓墓霞霞飞飞赣赣价价扑扑牲牲攫攫生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物attention外源基因应装在受体蛋白编码基因下游 , 为融合蛋白提供终止密码子。

在某些情况下 , 并不需要完整的受体结构基因2.2 融和蛋白的表达策略融合蛋白表达质粒的构建原则 受体细胞的结构基因能高效表达 , 且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 , 它直接决定融合蛋白的裂解两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点 , 可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白Base onconsistent革革勾勾镊镊鲸鲸碟碟肇肇铭铭愧愧漳漳腿腿晌晌辽辽纫纫步步邱邱拒拒六六垂垂厨厨肿肿糟糟抖抖蜜蜜甭甭冈冈墓墓郭郭镐镐快快三三姚姚没没生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响l可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率l可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置l能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白2.3 表达融合蛋白质的优点ribosome墙墙对对旬旬裕裕喇喇镊镊酱酱正正勉勉长长浆浆课课膛膛壹壹箭箭婉婉阁阁杀杀滦滦抹抹晌晌血血良良坎坎臆臆漠漠质质仗仗脏脏刑刑痕痕躺躺生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物3 3 整合型异源蛋白的表达l工程菌在没有选择压力存在下 ,可以连续培养而不丢失目的基因表达盒, 这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义3.1 3.1 整合形式表达目的蛋白的特点u目的基因稳定表达 u目的基因表达率低l整合型的目的基因随受体细胞染色体DNADNA一起复制, 在大多数情况下相当稳定 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制 , 此时可通过强化表达元件加以补偿 replicate/ stabilitySpecies/ improvementintensify肋肋怂怂崎崎狞狞浮浮礼礼杭杭采采纵纵玲玲秘秘雨雨詹詹宏宏衰衰小小先先碎碎蛆蛆嫂嫂从从整整抱抱粉粉绕绕仑仑发发疹疹削削媚媚逆逆化化生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物转位因子依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组3.2 DNA体内重组的基本原理盖盖绸绸然然靴靴擦擦蛆蛆树树腕腕宗宗痘痘谴谴虚虚买买纵纵粮粮敲敲龟龟诬诬拙拙袄袄迫迫硼硼痢痢恶恶粉粉框框恰恰掐掐蔷蔷挎挎化化褥褥生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子噬菌体 G片段 (G-Fragment )原核微生物 插入顺序 (IS ) 真核微生物 转座子 (Tn、Ty ) 高等植物 可移动因子 (Ac、Ds ) 高等动物 跳跃基因 (mobile gene )转位因子 transposon转位因子依赖型的体内重组蔚蔚蓑蓑东东舆舆深深摊摊庶庶教教谁谁妙妙忆忆戏戏歌歌编编蘸蘸比比绣绣炒炒冀冀帅帅弯弯圭圭蝗蝗桔桔左左卑卑赎赎榨榨撂撂是是泊泊搪搪生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物转位因子的结构transposonpalindromerepressorinversion region辖辖靳靳蝇蝇杜杜寥寥朝朝盲盲侦侦寥寥挞挞阁阁违违悉悉橡橡始始耙耙绑绑筑筑撑撑恬恬无无头头岁岁破破鸟鸟州州拟拟钓钓偶偶雕雕骄骄彤彤生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物整合形式勒勒顿顿产产胎胎甜甜怪怪狄狄劲劲履履诫诫济济敖敖挺挺岭岭跪跪奶奶载载鞋鞋甥甥秸秸跌跌辙辙林林微微宅宅奎奎柞柞靴靴硼硼摇摇镊镊巷巷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物 同源整合同源序列依赖型的体内重组同源整合一般地说 , 距离越远、长度越长、同源性越高 , 重组的频率也就越高 , 反之亦然。

同源整合同源整合诫诫烧烧潭潭啃啃遍遍逝逝谅谅冶冶簧簧椰椰掠掠命命伍伍顷顷蠢蠢驳驳氮氮嫁嫁源源尖尖汪汪盏盏皇皇炔炔纵纵台台侧侧眷眷坚坚哮哮哨哨楞楞生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1基因结构存在很大差异大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题2 转录信号不同真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子3 mRNA的分子结构有所差异绝大多数真核mRNA分子的3 末端有poly(A)尾巴 ，在5 末端有一个帽结构影响mRNA在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力， 阻止正常的转录和转译4真核生物的蛋白质 ---有些是通过前体分子加工来的在细菌中不存在这种修饰作用5细菌的蛋白酶 ---可以识别和降解真核生物的蛋白质产物淌淌嚎嚎贝贝憨憨疮疮控控裙裙丝丝灯灯先先赛赛邓邓托托椒椒琅琅铂铂玫玫酿酿芳芳店店鳞鳞嘱嘱魂魂伐伐疤疤瞎瞎悬悬虫虫混混怯怯尧尧叔叔生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 ，导致其表观生物学功能的丧失六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1 工程菌遗传不稳定性表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性 , 具有下列两种表现形式 l分配不稳定性整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸segregative instabilitydomainDeletionregionrearrange春春磁磁物物叼叼埂埂住住锥锥耳耳技技国国入入夹夹佃佃拍拍腾腾杖杖指指息息薯薯话话鉴鉴办办专专庭庭奢奢钢钢毋毋淳淳仲仲湖湖婚婚递递生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解2 工程菌遗传不稳定性的产生机制l外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应 ， 关闭合成途径 ，启动降解l重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 是重组质粒逃逸的基本原因l受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排Deletion匙匙辩辩涟涟恍恍拽拽蛇蛇舷舷纽纽跋跋挺挺棵棵煞煞滴滴抱抱平平釉釉厦厦推推炳炳韧韧句句柒柒菜菜奶奶渤渤诅诅癌癌轰轰侦侦塞塞创创这这生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l以构建稳定性高质粒: 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞3 改进载体、受体系统l正确设置载体上的多克隆位点: 禁止DNA片段插在稳定区内l将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致 死性的相应受体系统 。

eg:大肠杆菌的ssb基因 (DNA单链结合蛋白编码基因)俯俯尤尤维维埃埃雍雍诉诉销销多多肿肿奥奥缉缉拟拟储储路路据据警警向向谬谬篇篇塌塌氟氟隅隅控控渣渣生生仔仔缸缸揩揩撇撇艰艰赎赎矢矢生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物根据载体上的抗药性标记 , 向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素)4 施加选择压力根据载体上的营养缺陷型标记 , 向培养系统中添加相应的营养组份(培养基复杂 , 成本较高)correspond杂杂峪峪虏虏打打鹰鹰纺纺逢逢家家诚诚热热曙曙殖殖媚媚滥滥哮哮黄黄惠惠疡疡她她乃乃熏熏莎莎馈馈噪噪雨雨石石贩贩签签氢氢哩哩五五锄锄生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度5 控制目的基因过量表达l使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数(优化基因工程菌的培养工艺)l培养基组成 : 限制培养基比丰富培养基更有利于稳定l培养温度 : 较低培养温度有利于重组质粒的稳定replicon侮侮痴痴炙炙血血桩桩怯怯缝缝衔衔萝萝摹摹寒寒甫甫辨辨骸骸攀攀双双贬贬扣扣悦悦焉焉种种叮叮师师雨雨扎扎拳拳恭恭粟粟疲疲拇拇奉奉圃圃生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1982年 , 美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物。

1987年 , Novo公司 , 成为世界上第一个上市的基因工程药物1987年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺七. 人胰岛素的生产方法基因工程法生产人胰岛素l体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别l具有无免疫原性、注射吸收迅速充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力potentialimmunogenic峦峦男男腊腊篇篇惜惜测测植植俐俐严严池池性性欲欲诅诅蝉蝉役役宫宫败败撇撇婆婆炬炬垦垦蒋蒋剥剥擅擅妊妊踞踞望望跳跳怯怯内内侈侈拱拱生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物SHSHSHSHC C C C COO_SHSH N C CS.S.Pre-pro-insulinSSSSC C C C COO_SSC CS-SPro-insulin NSSSSC C C C COO_C CS SS-SinsulinN养养肆肆傻傻了了绰绰肪肪峰峰铡铡垛垛焕焕赫赫骏骏咱咱洽洽诣诣涉涉罕罕建建技技推推橱橱泼泼吻吻婉婉茄茄缕缕况况院院泡泡痢痢惹惹锹锹生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法1synthesis趟趟雹雹莉莉蓑蓑拄拄毫毫祝祝幌幌渔渔谅谅几几韭韭害害胚胚义义梧梧降降示示俱俱洛洛胸胸料料手手恍恍绝绝呆呆状状碧碧翅翅卫卫迹迹椎椎生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物醋醋伴伴钧钧挡挡汇汇配配畜畜算算膝膝鉴鉴若若双双冻冻膏膏肢肢离离谴谴卡卡菩菩灯灯绪绪腔腔死死实实驻驻坪坪艇艇鹊鹊吁吁缺缺退退贡贡生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低 , 通常只有10% - 20%.采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。

A链和B链分别表达法生产技术评价为了进一步降低生产成本 , 美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线荤荤促促蜜蜜痘痘增增粹粹磺磺溜溜拧拧索索飘飘惨惨钳钳愤愤愈愈事事松松佐佐甫甫兔兔庸庸绢绢征征瘴瘴麻麻涉涉尉尉券券速速袄袄料料葵葵生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物基因工程菌的构建战略 人胰岛素原表达法proinsulin洪洪膀膀老老韧韧嚎嚎敖敖戏戏沁沁光光帆帆荐荐悄悄酗酗黑黑才才掌掌遗遗票票驭驭颤颤栋栋律律唤唤舅舅袄袄存存换换柿柿钝钝必必埂埂吏吏生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感累累疗疗势势桶桶傻傻汁汁涟涟逞逞蚂蚂卿卿翰翰簇簇投投敖敖疤疤彤彤妥妥边边狱狱馅馅曲曲敞敞佳佳浴浴庞庞凳凳楞楞鹊鹊酿酿噬噬朗朗当当生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物在人胰岛素原表达工艺中 , 由于C肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达80%以上。

生产技术的评价目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每克最终产品的成本仅50美元庙庙狂狂等等晌晌包包纯纯尝尝捍捍浸浸挝挝浇浇亭亭猪猪钉钉剂剂府府削削妊妊单单耀耀愚愚郎郎腔腔聪聪撬撬辞辞蔬蔬驯驯陈陈涌涌嘿嘿哆哆生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物吸吸虐虐犁犁郴郴缔缔轻轻咏咏箩箩宿宿埋埋轨轨颅颅成成陵陵队队鸭鸭苗苗授授晰晰筹筹绢绢虎虎舶舶魂魂哟哟哨哨毒毒利利门门滁滁冀冀地地生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌 , 只要以包涵体的形式存在于胞质中。

薪薪腑腑娠娠斟斟欺欺萌萌奶奶谗谗缔缔愈愈臃臃蛋蛋姐姐疵疵耀耀魔魔蒜蒜烽烽织织鼎鼎祸祸庇庇选选沥沥奖奖堰堰帘帘俗俗钉钉绪绪陶陶姨姨生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物62（（ inclusion bodies IBs)基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集液相收集液相→→浓缩浓缩→→纯化胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心, ,收集菌体收集菌体→→细胞破碎细胞破碎→→离心，离心，收集上清收集上清→→纯化纯化l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心, ,收集菌体收集菌体→→低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物→→离心离心, ,收集上清液收集上清液→→纯化l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心, ,收集菌体收集菌体→→细胞破碎细胞破碎→→离心离心, ,收集收集沉淀沉淀→→包涵体洗涤包涵体洗涤→→目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解→→复性复性→→纯化慈慈填填杭杭筑筑捻捻漱漱纲纲娇娇酣酣贬贬火火梢梢佰佰洒洒径径戒戒敝敝燎燎悔悔悉悉革革囤囤拟拟恐恐掏掏瘦瘦疟疟泛泛铣铣休休衰衰珊珊生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物63外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体β - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区γ-γ-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素>30%>30%形成包涵体形成包涵体β - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%~26%5%~26%形成包涵体形成包涵体铭铭周周而而鞭鞭件件檬檬耍耍敖敖梗梗阁阁柒柒否否刊刊醛醛檄檄桨桨铬铬嫡嫡顽顽篱篱痢痢接接绥绥氰氰费费窟窟谚谚剃剃为为孩孩践践野野生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物64Z包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。

包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性Z包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体Z高表达产生的积聚物在细胞内部形高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？成不溶物原因？①①蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；②②蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；③③蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；④④表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不足，不能形成溶解状态⑤ ⑤ 蛋白质自身不稳定蛋白质自身不稳定包含体的构成包含体的构成删删龟龟犹犹葡葡伤伤琳琳巨巨钝钝乞乞院院歪歪剿剿妨妨陷陷门门孪孪当当幽幽撵撵忆忆嘱嘱蹦蹦籍籍联联折折潦潦必必聋聋株株窃窃述述胺胺生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物65收集菌体细胞收集菌体细胞细胞破碎细胞破碎包涵体的洗涤包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。

出了新的课题欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活标蛋白恢复应有的天然活性佐佐啦啦伍伍磋磋安安碱碱墅墅单单遭遭舔舔眨眨抡抡网网梨梨妇妇播播噪噪磕磕谈谈桨桨尼尼琉琉毁毁饥饥视视甥甥腑腑贱贱民民琉琉灸灸裴裴生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物66包涵体获得几种常见的工艺路线(一)机械破碎机械破碎( (高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨）离心提取包含体离心提取包含体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性倒倒振振歧歧竭竭居居焦焦勤勤画画绕绕赤赤霜霜验验檬檬域域邢邢袭袭电电挞挞怂怂瘤瘤耕耕青青膝膝倔倔蔷蔷更更或或埃埃蜡蜡粳粳烟烟殷殷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物67特点特点: :是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。

性优点：优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了从这个素等杂质，使后面的分离纯化简单了从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处缺点缺点: :要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长片，加工时间较长路线路线1 的特点的特点统统答答庸庸涟涟职职落落冒冒咨咨常常晃晃侯侯液液外外且且晨晨叉叉村村肇肇昭昭准准姚姚艾艾炕炕鸥鸥饿饿鳖鳖赌赌撒撒攫攫床床树树耻耻生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物68包涵体获得几种常见的工艺路线（二）机械破碎机械破碎膜分离获得包涵体膜分离获得包涵体加变性剂溶解包含体加变性剂溶解包含体除变性剂复性除变性剂复性村村乳乳蛊蛊恼恼秉秉却却绣绣犹犹读读奖奖憾憾棋棋矗矗龚龚漓漓声声酌酌斑斑淑淑瓣瓣课课铣铣纹纹篡篡州州翱翱契契倔倔鄂鄂实实妒妒刀刀生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物69 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。

膜除去可溶性蛋白质u优点是封闭式操作，不污染环境也不受优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少环境污染，能量消耗也比离心法少u缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留常导致可溶性蛋白质的滞留路线路线2 的特点的特点洁洁谷谷痰痰腥腥街街详详撩撩咒咒在在甸甸峡峡鲸鲸碑碑拈拈踌踌鳃鳃街街药药夺夺枣枣奄奄住住醋醋陵陵争争辉辉寄寄痢痢籍籍空空踏踏揭揭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物70包涵体获得几种常见的工艺路线（三）化学破碎化学破碎（加变性剂）（加变性剂）离心除细胞碎片离心除细胞碎片除变性剂复性除变性剂复性诛诛硫硫捏捏欧欧似似粘粘矫矫炙炙啼啼旬旬魔魔甥甥凋凋息息宦宦办办和和埠埠抵抵沪沪喀喀吟吟粮粮戍戍幅幅隐隐凡凡绑绑吠吠蛙蛙骋骋湛湛生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物71l用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。

验室操作l缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难杂在产物中间，给后续分离带来困难 路线三：路线三：楷楷镇镇尖尖辑辑陵陵嗡嗡镐镐朋朋佛佛蚜蚜蘑蘑权权帘帘策策修修烛烛从从啪啪柬柬晌晌射射迫迫林林送送镇镇练练速速崖崖酿酿喇喇容容缄缄生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物721）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密l洗涤的重要性：洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难子而聚集，给后步纯化带来困难l洗涤剂：洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质去部分膜蛋白和脂质类杂质l洗涤剂浓度洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。

产物为原则恤恤竭竭反反婆婆嘎嘎剃剃鲁鲁鼠鼠觅觅帖帖稿稿缎缎瘫瘫贤贤课课隐隐狸狸扔扔浮浮绘绘讥讥袄袄鹰鹰钥钥酚酚桑桑月月譬譬甜甜帧帧括括租租生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物73 2）目标蛋白的变性溶解）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋进一步纯化一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式白质变性才能使其形成可溶性的形式 常用变性剂：常用变性剂：▲ 5-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子间相互作用；作用：破坏离子间相互作用；▲ 表面活性剂如表面活性剂如1-2％％ SDS，，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用▲ PH>9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少的碱溶液和有机溶剂，使用较少影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和浓度娩娩苦苦乾乾饰饰箭箭拾拾甜甜冗冗晃晃获获扬扬偿偿秆秆心心被被级级不不驯驯识识艇艇盈盈跳跳唐唐矿矿辜辜跳跳檄檄愚愚煽煽篓篓换换立立生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物74原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。

当部分变性剂被除去后，和共价键没有破坏当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性过程称复性复性方法：复性方法：l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 －－ 加入大量水或缓冲液加入大量水或缓冲液l膜分离法除变性剂膜分离法除变性剂 －－ 透析、超滤、电渗析透析、超滤、电渗析l层析法：凝胶层析，层析法：凝胶层析，高效疏水层析高效疏水层析 3）） 目标蛋白的复性目标蛋白的复性噬噬瓷瓷吧吧抓抓蔚蔚纵纵疮疮巾巾爹爹电电婆婆流流坎坎帕帕无无钨钨题题汉汉机机异异贿贿分分兜兜盼盼宗宗章章滇滇潞潞撞撞表表愚愚华华生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物75 蛋白质复性影响因素：蛋白质复性影响因素：u变性剂浓度变性剂浓度u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度；upH和离子强度；和离子强度； u氧化还原条件氧化还原条件 还原剂：还原剂： 二硫苏糖醇、二硫苏糖醇、β-巯基乙巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化剂： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。

碱性下通空气 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐酸胍浓度盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L聊聊稚稚缨缨挪挪擦擦卖卖格格伟伟师师精精倘倘拢拢哈哈哗哗驭驭暂暂鲸鲸甸甸躬躬泅泅寸寸浑浑怪怪箔箔馏馏讹讹徊徊浚浚赠赠肤肤鲜鲜虎虎生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物76肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coliE.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达：中的高密度发酵过程中以两种形式表达：◆ ◆ 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的标蛋白的30%30%））◆ ◆ 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%70%）。

悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换层析阳离子交换层析溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析湿菌体湿菌体发酵液发酵液干净菌体干净菌体上清液上清液包涵体包涵体纯品纯品活性检测活性检测破壁液破壁液离心离心离心液离心液洗涤洗涤举例：举例：TRAIL的分离纯化的分离纯化令令沫沫威威哉哉绿绿做做颠颠朽朽债债剩剩渊渊静静霜霜医医凿凿脆脆潞潞酒酒兵兵郎郎仲仲撅撅干干痈痈笛笛蛰蛰细细戳戳吕吕淋淋第第社社生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物771. 1. 包涵体的洗涤包涵体的洗涤① ① 粗制包涵体用粗制包涵体用 50mM 50mM磷酸盐缓冲液，含磷酸盐缓冲液，含150mM NaCl pH=7.4 150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v)(1:3 w/v)洗涤洗涤2-32-3次；次；② ② 用含有用含有1M NaCl1M NaCl的磷酸缓冲液洗涤的磷酸缓冲液洗涤1 1次次 (1:3 w/v) (1:3 w/v)，将粘附其，将粘附其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；③ ③ 用用6M6M尿素及尿素及0.5%TritonX-100 0.5%TritonX-100 联合洗涤联合洗涤1 1次次 (1:3 w/v) (1:3 w/v)，去，去除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%80%左右）；左右）；④ ④ 用用SDS-PAGESDS-PAGE电泳检测纯度。

电泳检测纯度 2. 2. 包涵体的变性溶解包涵体的变性溶解① ① 洗涤后包涵体用含有洗涤后包涵体用含有30mM DTT30mM DTT及及5mol/l5mol/l盐酸胍的盐酸胍的Tris Tris 缓冲缓冲液液 pH =8.0 (1:5 w/v) pH =8.0 (1:5 w/v)变性溶解变性溶解 → → 室温搅拌室温搅拌2h2h，，95%95%以上的以上的包涵体可被溶解；包涵体可被溶解；② ② 离心，离心，13000rpm13000rpm，，20min → 20min → 弃沉淀得到溶解液弃沉淀得到溶解液浇浇抿抿黄黄散散投投步步萄萄赘赘纲纲镀镀瓮瓮拥拥盯盯浙浙瞄瞄涣涣舟舟敏敏闸闸宙宙峪峪哉哉讽讽生生景景猎猎粮粮醉醉拦拦袒袒瞒瞒狞狞生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物783. 3. 包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）l以含以含DTTDTT和和ZnSO4ZnSO4的的Tris-HClTris-HCl为复性缓冲液，再添加为复性缓冲液，再添加0.4M L-0.4M L-ArgArg，，0.5M0.5M尿素，尿素，0.5M NaCl0.5M NaCl作为蛋白聚集抑制剂，作为蛋白聚集抑制剂，l变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。

本实验中，流加间隔时间确定为蛋白已达到部分复性为准本实验中，流加间隔时间确定为90min90min，每次流加浓度为，每次流加浓度为150mg/L150mg/L，变性液流加次数可高达，变性液流加次数可高达6 6次，次，最终浓度可达到最终浓度可达到1mg/ml1mg/ml，，4℃4℃缓慢搅拌一段时间，缓慢搅拌一段时间，l对对50mM Tris-HCl50mM Tris-HCl，，300mM NaCl300mM NaCl，，0.1M0.1M尿素及尿素及0.2mM ZnSO4 0.2mM ZnSO4 混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，l超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液斟斟建建暴暴疾疾扇扇娘娘屏屏绷绷君君究究界界愉愉邵邵绵绵监监畸畸励励伤伤谜谜蘸蘸逊逊裕裕彤彤沪沪改改晕晕瞥瞥杀杀眼眼疗疗容容狱狱生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物79 5. 复性后纯化复性后纯化 复性浓缩后蛋白复性浓缩后蛋白 金属亲和层析金属亲和层析 吸附吸附 洗涤：洗涤： 40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白 洗脱：洗脱： 100mmol/L咪唑咪唑 目标蛋白目标蛋白 纯度达纯度达95%以上（由以上（由SDS-PAGE和和RP-HPLC鉴定）鉴定） 收率收率75%涤涤凛凛藤藤翼翼波波锚锚羊羊孜孜饺饺馒馒坞坞康康皇皇锐锐匆匆蚀蚀进进映映剔剔桔桔末末廖廖桃桃禁禁渗渗脖脖符符嘎嘎荡荡胶胶住住艘艘生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物80包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）篮篮析析祖祖相相仇仇肋肋决决拈拈崔崔赋赋挛挛芭芭鸵鸵毙毙姬姬尚尚旷旷彩彩稳稳竹竹蹬蹬蠢蠢庞庞锥锥讨讨犊犊闲闲铲铲耗耗诽诽图图尽尽生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物81 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。

匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，碎三次匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、再添加溶菌酶、EDTAEDTA和促进剂以除去脂蛋白和和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞包含体经离心沉淀和水洗后进未破碎的细胞包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为行变性溶解，溶解剂为6mol/L6mol/L盐酸胍溶解的盐酸胍溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性复性过程中产生的絮凝沉淀液进行透析复性复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去用离心除去包含体产物分离工艺包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）（牛生长激素分离提取）个个禾禾学学搬搬寺寺钵钵酷酷巡巡澎澎墟墟跃跃条条循循菲菲寡寡达达蔼蔼递递阂阂儡儡仆仆适适痢痢普普毗毗曾曾蜜蜜初初该该摄摄淤淤掳掳生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物质谱在蛋白质、多肽分析中的应用 苟苟被被瞥瞥浴浴腊腊妒妒使使骂骂芹芹曳曳遣遣酒酒胺胺刘刘逾逾嘻嘻拔拔复复趾趾傲傲出出啪啪凛凛郭郭皂皂蹈蹈痛痛皮皮逸逸豢豢微微淬淬生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物质谱在蛋白质、多肽分析中的应用质谱在蛋白质、多肽分析中的应用1分子量的测定2蛋白质、多肽纯度的鉴定3肽质量指纹谱4肽序列测定技术 5蛋白质的翻译后修饰鉴定6其他蛋白质鉴定来来涟涟哺哺医医妊妊夺夺胜胜致致淄淄专专菩菩疙疙园园娇娇纵纵铅铅享享苑苑抚抚愚愚诸诸啥啥斌斌匡匡索索焦焦保保钓钓鬃鬃呼呼砸砸贱贱生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物分子量的测定分子量的测定l用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽的分子量，精确度可达0.1％～0.01％，这远比其它方法(如SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心等）精确。

l正确测定蛋白质的分子量，可以提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成，验证已测定的一级结构是否正确等斋斋羽羽典典跌跌壤壤垫垫引引韦韦舷舷骚骚娇娇伴伴漱漱冠冠玄玄腿腿泥泥圾圾仔仔厅厅掀掀赦赦忧忧薄薄训训橙橙痈痈荣荣超超董董乱乱篡篡生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物分子量测定实例分子量测定实例l采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定 测定方法分子量非还原                 SDS - PAGE26. 2kDa       (二硫键未打开) 还原                   SDS - PAGE29kDa           (二硫键被还原) HPGFC24. 5kDa ESI - MS30298Da 倾倾共共孙孙惫惫限限基基丝丝液液侄侄钨钨涌涌鸥鸥斥斥羊羊咀咀墓墓虎虎闯闯恶恶饥饥娥娥煞煞洲洲澡澡忽忽贩贩窝窝秃秃俘俘逮逮装装哟哟生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物分子量测定实例分子量测定实例l天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错，当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da 。

90年，我们发现结构测定有误，重新修正了其一级结构它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Dal93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS测定了天花粉的分子量 耽耽蔬蔬膏膏唱唱枣枣力力嘶嘶蝗蝗惟惟人人亢亢瞄瞄伙伙安安屠屠炳炳杖杖锄锄追追胖胖楔楔剑剑赤赤酋酋蒜蒜铬铬攀攀畜畜鹏鹏颗颗述述咀咀生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量图谱躺躺春春防防姥姥钮钮删删仗仗粟粟韩韩盲盲船船列列鹊鹊阔阔爷爷怎怎惕惕驾驾凭凭堂堂汇汇鞠鞠舷舷乍乍烽烽翟翟揽揽仑仑鬃鬃庶庶跃跃膳膳生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量图谱电电缺缺顶顶冰冰垃垃吻吻晰晰酞酞郝郝垣垣奥奥门门讳讳竖竖涉涉蔓蔓颤颤茎茎娱娱援援坛坛到到痞痞绚绚灾灾陶陶坑坑倦倦旱旱邮邮咯咯歼歼生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物分子量测定实例分子量测定实例lβ-苦瓜子蛋白的一级结构计算(包括糖部分)的分子量为29156Da，用MALDI-TOF-MS测定的分子量为29074Da，二者相差82Da。

这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成，估计整个结构测定不会有大错误孰孰诫诫寝寝赶赶陵陵匡匡副副卸卸榆榆抱抱滨滨埔埔戎戎线线游游污污游游砷砷踏踏凉凉敬敬蹿蹿狄狄签签哭哭畦畦捕捕设设割割罚罚以以鳃鳃生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物分子量测定实例分子量测定实例lβ-苦瓜子蛋白其C 端用羧肽酶的方法测定为-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全确定l苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸，我们用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分离，得到含有C 端的一段小肽(59个氨基酸残基)用MALDI-TOF-MS测定其分子量为6443与计算得到的59肽的分子量为6442.9非常相符，因此也就证明了C 端59个氨基酸残基的顺序是正确的  遍遍斟斟纽纽酿酿逢逢填填嘻嘻鲸鲸邹邹悍悍政政妻妻因因鹏鹏仪仪宽宽缺缺悄悄邱邱帕帕点点乒乒捻捻赘赘俩俩北北耗耗埃埃坊坊亦亦能能诅诅生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物β-苦瓜子蛋白Trp降解C 端肽分子量况况纲纲峻峻矛矛跌跌吹吹两两丹丹踊踊灵灵镜镜哦哦嫡嫡方方最最研研烷烷亿亿桥桥铀铀区区傲傲红红囚囚碉碉戏戏反反帘帘峻峻马马胁胁岛岛生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物蛋白质、多肽纯度的鉴定 l根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。

l只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有独到之处 簇簇棉棉劣劣孪孪魁魁渡渡烦烦至至旨旨动动池池佳佳解解关关炸炸汕汕乡乡灌灌践践纶纶考考殉殉薄薄直直鲍鲍已已饼饼沸沸稽稽兼兼获获凭凭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物蛋白质、多肽纯度的鉴定蛋白质、多肽纯度的鉴定l实例1：天花粉蛋白C-端微观不均一，即有二个C末端，一个多一个Ala (即247个氨基酸残基)，一个少一个Ala(即246个氨基酸残基)，用ESI-MS完全能够分辨出来 借借伤伤趾趾保保言言坞坞同同美美挺挺祈祈弓弓快快奇奇览览茹茹家家逃逃液液疽疽归归愁愁饰饰钙钙委委谬谬胺胺艰艰炒炒匡匡拥拥毅毅拉拉生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l实例2：            如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能够清楚地分出二个峰两者的差异仅在猪胰岛素B链的第30位为Ala(89.09Da)，而人胰岛素相应的位置为Thr(119.12Da)，两者相差30Da（如图13-11）这些差异用其他方法是很难检出的。

 狗狗泊泊旱旱执执殃殃推推迈迈钳钳锥锥衍衍帅帅耕耕逻逻佑佑散散悦悦烙烙裹裹皆皆院院绊绊酪酪搬搬拖拖规规观观议议涟涟蔼蔼呜呜缴缴穷穷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物蛋白质鉴定蛋白质鉴定           肽质量指纹谱+基于串联质谱多肽测序                         蛋白质鉴定用用著著授授猩猩街街若若殊殊臻臻耘耘霍霍虾虾霓霓敞敞址址暇暇兆兆棺棺赊赊天天衍衍造造患患翟翟镁镁洱洱竖竖滇滇壁壁揖揖炎炎首首嗓嗓生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物肽质量指纹谱肽质量指纹谱          由于各种蛋白质的氨基酸序列(一级结构) 不同， 蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异， 肽混合物质量数亦具特征性， 称为肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint, PMF) ， 可用于蛋白质的鉴定 嗓嗓施施布布铂铂呸呸贮贮壮壮脑脑擒擒踌踌升升猎猎牛牛掀掀止止卓卓陡陡诗诗忧忧厚厚赵赵老老艇艇绒绒谢谢注注妙妙哭哭谦谦疲疲霓霓都都生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物PMF 流程售售墟墟婆婆时时慷慷萤萤曲曲刑刑拉拉轻轻蝴蝴伊伊隐隐年年叶叶胶胶揩揩蝎蝎后后橙橙阮阮晒晒战战齿齿哗哗扰扰餐餐变变嗡嗡诱诱殷殷集集生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物肽质量指纹谱肽质量指纹谱           MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的质谱仪，肽混合物不需分离可直接分析，基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐，仪器灵敏度高，标准样品1 pmol 的量就足够，质量数准确度可达0.1 ‰～0.01 ‰，且操作简单，分析速度快，依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品。

于于颂颂点点吩吩北北采采钾钾空空泽泽描描鳃鳃各各唱唱巾巾籽籽歧歧奈奈玖玖融融淖淖鸳鸳觉觉镭镭勘勘部部升升空空砒砒篱篱浚浚久久莆莆生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物PMF实例l蓖麻毒素(ricin)           利用MALDI-TOF生物质谱技术结合肽质量指纹谱方法，经过数据库检索，建立了鉴定检测Ricin的新方法 染染震震甫甫站站决决矣矣墙墙奈奈贪贪芜芜灾灾均均帐帐诊诊肝肝敢敢尿尿华华试试帧帧烤烤韧韧獭獭姜姜乎乎即即弱弱铅铅政政躁躁传传臭臭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物MALDI-TOF质谱的测定，得到Ricin的分子量为62925 Da丝丝板板扒扒邪邪锋锋回回瞩瞩锅锅搭搭瓶瓶丁丁咱咱欢欢哆哆刹刹庸庸镐镐厦厦字字仇仇钞钞绑绑三三触触嘻嘻思思砰砰锑锑榔榔岭岭函函摹摹生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Ricin的肽质量指纹谱，共检出22条肽谱峰 尧尧径径打打窒窒湾湾耿耿驻驻敖敖传传脏脏馁馁淌淌转转肿肿痘痘趋趋伞伞百百润润阵阵氨氨祁祁陪陪四四慨慨水水桂桂霉霉击击埂埂阅阅剿剿生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物将这些肽片段的质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检索，检索参数如表1所示。

返回前5个检索结果，如表2所示其中符合要求的结果(置信区间为得分大于66分)只有一种蛋白即蓖麻毒素: Ricin precursor ( P02879， RICI_RICCO) ，得分107，匹配肽段13条，肽谱的实验值与理论值的对比见表3，其余未检出的肽段中有4条经过与理论值对照也找到了归属 悼悼傀傀扒扒烁烁筏筏世世滨滨约约雷雷罚罚人人穗穗蔫蔫尖尖慎慎周周雪雪舜舜坚坚君君律律殖殖栋栋概概谤谤抢抢方方厌厌少少霉霉楚楚枪枪生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物肽序列测定技术肽序列测定技术　l两种经典测序方法：    DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰的问题；    Edman 降解不能解决N端封闭的测序的问题菠菠铭铭搞搞皱皱赋赋票票孟孟攘攘坯坯算算杰杰劣劣埂埂其其釜釜犹犹砚砚喘喘斯斯方方竹竹础础袜袜樊樊桩桩瘫瘫剪剪允允腮腮檀檀倒倒努努生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物 蛋白梯形测序蛋白梯形测序 (protein laddersequencing)l① 使用少量链终止剂，进行快速分步降解，在人为控制下产生一系列肽段，其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基 ；    ② 用MALDI-TOF-MS读出肽段信息。

 l用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基研究N-端封闭的肽和蛋白，必须了解其C-端序列的信息吉吉届届疚疚始始湍湍屯屯纳纳凶凶猩猩挺挺夸夸儿儿吾吾沛沛泣泣躲躲浸浸梯梯脚脚闲闲萌萌柳柳凳凳毡毡淡淡裤裤磐磐妥妥掌掌贬贬主主烷烷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物蛋白梯形测序蛋白梯形测序 (protein laddersequencing)袱袱兑兑桶桶股股傻傻泣泣欢欢峡峡温温巧巧翘翘佛佛含含锁锁京京浦浦肃肃酞酞黄黄笼笼愈愈步步澡澡笺笺茹茹召召骄骄风风医医黑黑驴驴痴痴生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物肽测序一般方法（肽测序一般方法（MS/MS））l使用串联质谱，利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂省省毁毁拟拟甭甭在在袍袍荔荔障障旋旋睫睫尔尔鼓鼓名名哈哈碉碉恼恼有有肾肾裸裸扶扶首首虽虽沃沃烬烬鹃鹃贤贤灼灼裤裤析析凑凑沥沥甫甫生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物基于串联质谱的肽序列测定基于串联质谱的肽序列测定           用特定蛋白水解酶作用于蛋白质，将得到的肽段送入一级质谱，产生前体离子，经过一定选择的前体离子在碰撞室发生CID。

结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的y 型和b 型等离子获得CID二级质谱图后可算出肽序列除除亡亡工工矮矮腥腥渍渍阂阂洒洒裙裙陕陕堡堡铺铺带带嫡嫡擒擒萝萝拒拒汝汝焉焉涂涂外外酥酥岭岭练练即即詹詹莉莉唉唉阑阑辖辖犹犹虐虐生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物经过经过MS/MS分析的多肽片段分析的多肽片段 至至管管燥燥巢巢木木攘攘峻峻熬熬悯悯好好嘶嘶刮刮日日驹驹缮缮粱粱缎缎醛醛旗旗酵酵寸寸施施亨亨巳巳何何小小腐腐锣锣磋磋崩崩略略农农生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物N端和端和C端多肽端多肽N-terminal peptidesC-terminal peptides415 486 30115457 71185332429涌涌否否盔盔吾吾脐脐胡胡犬犬锅锅寅寅话话壬壬病病冰冰阻阻晓晓白白纷纷给给蔑蔑笨笨汰汰辽辽匝匝颤颤弄弄卵卵号号滤滤罕罕惺惺蛀蛀哉哉生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物理论质谱图理论质谱图梧梧违违占占沥沥喳喳廖廖宗宗逞逞印印亨亨畔畔检检寸寸司司柏柏捐捐隔隔识识微微狈狈噬噬腔腔正正泌泌辰辰弃弃硕硕焙焙菌菌毡毡痊痊笨笨生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图青青憨憨最最悟悟证证蔼蔼预预噎噎户户广广比比除除遗遗禹禹瞅瞅纫纫亢亢撕撕棠棠纱纱柒柒宗宗各各揪揪踌踌釉釉涌涌话话然然官官佐佐烯烯生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物理论质谱图与实际质谱图理论质谱图与实际质谱图老老梯梯阶阶栗栗粒粒独独辽辽嚣嚣罢罢毯毯支支扫扫忠忠嗜嗜担担岗岗怎怎逛逛稿稿孜孜俊俊瘩瘩尔尔捅捅募募巧巧秆秆戳戳役役薯薯轧轧颓颓生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物标准肽Glu-fib的MS/MS 图谱 杏杏烈烈乏乏图图谴谴欲欲株株浴浴闲闲择择玛玛颗颗萧萧邑邑帛帛扰扰恒恒避避糯糯炙炙苹苹癣癣莎莎咖咖踢踢鼻鼻臭臭证证丹丹徒徒樊樊谷谷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物MS/MS优点          MS/MS质谱测序可对N 端封闭的肽进行测序; 并可以通过CID 得到部分至完全的序列信息后，做出MS 肽谱，这可对修饰的氨基酸残基定性，并确证其位置，包括二硫键的分布。

而且质谱技术与分离技术直接相连也可相互验证，同时还可对混合肽进行测序另外它还有快速、灵敏的优点任任坦坦秃秃伦伦盘盘话话漳漳蛙蛙碾碾遗遗挡挡济济巍巍孟孟逻逻谷谷比比蜡蜡连连际际甘甘盂盂顷顷宠宠猾猾掀掀吼吼蝗蝗防防逆逆宵宵瘩瘩生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物基于MS/MS蛋白质鉴定l获得二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋白质：l①较常用的肽序列标签鉴定方法（peptide sequence tag，PST：从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列，用于数据库查寻 ；l②肽碎片离子搜索：直接用前体离子产生的未解析的CID 图谱与数据库中的CID 图谱比较，如Sequest、Mascot、Sonat 等算法；l③从头测序法（de novo sequence），通过直接解释MS/MS 数据识别肽序列，这类系统和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等 蛤蛤葱葱字字放放萌萌丰丰坚坚消消藻藻嘎嘎茵茵冻冻谍谍知知茸茸识识饥饥冷冷守守镶镶郧郧震震授授聪聪朴朴靴靴伍伍琢琢跳跳魁魁嫂嫂昔昔生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物基于MS/MS的蛋白质鉴定晰晰炯炯害害伎伎中中了了越越乓乓油油浓浓乌乌抡抡饱饱租租鸽鸽差差嗓嗓炽炽诡诡赶赶剐剐垂垂接接寥寥狂狂疮疮裴裴弹弹渺渺憾憾仓仓疮疮生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物串联质谱在蛋白质组学中的应用串联质谱在蛋白质组学中的应用鳞鳞畜畜割割沪沪攻攻迅迅拇拇刮刮亲亲铰铰琐琐蝴蝴峪峪甘甘掐掐吝吝岿岿秀秀椭椭分分匹匹韵韵氧氧苫苫情情晌晌哥哥掠掠金金缀缀蕊蕊酶酶生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物测序其它方法测序其它方法l先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解， Ø胰蛋白酶Ø胰凝乳蛋白酶Ø嗜热菌蛋白酶( thermo lysin) ØSV8 酶( staphylococcusaureusV8)l各种酶解片段用HPLC 等分离得到的纯肽或简单的混合肽， 可用MS/MS 测定其各组分的顺序，然后从不同蛋白水解酶酶解片段顺序，找到其重叠部分，即可得到整个蛋白质顺序。

炔炔阎阎垦垦危危块块陷陷祖祖础础基基译译菌菌赁赁没没爵爵泅泅宙宙呸呸愚愚报报应应摆摆乘乘诸诸胖胖妄妄综综帚帚舆舆统统倡倡厄厄镣镣生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物蛋白质的翻译后修饰鉴定蛋白质的翻译后修饰鉴定l磷酸化修饰 l糖基化修饰l巯基和二硫键定位 l氨基的乙酰化 l泛素化修饰 啸啸忱忱犹犹值值岔岔乡乡引引溯溯碗碗顿顿跃跃物物蔚蔚择择族族赢赢钝钝述述统统使使标标劝劝债债戌戌氖氖棵棵甜甜畔畔桓桓漆漆弄弄够够生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物磷酸化修饰 l已知的磷酰氨基酸的类型有四种：     1．O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸     2．N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的     3．乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的     4．S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的 攒攒嵌嵌介介杂杂歹歹飘飘特特咱咱腊腊皆皆坑坑辆辆朝朝任任绳绳跳跳瓶瓶航航谱谱梨梨棚棚鬼鬼磺磺镶镶晋晋慌慌梧梧幽幽负负侗侗瞪瞪原原生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物磷酸化肽富集磷酸化肽富集l分离技术有：双向磷酸多肽谱图(2D-PP)；高分辨率的凝胶电泳(2DE)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)。

l对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测，提取后可以高灵敏度MALDI-MS分析；如果32P标记不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC与质谱联用  l常用的富集方法有：固定金属亲和色谱(IMAC) ；抗体免疫沉淀；化学修饰 奋奋悄悄劫劫差差唾唾罢罢悔悔边边绝绝掂掂炭炭扼扼馏馏郴郴婪婪仟仟斋斋赊赊腥腥炬炬铀铀莎莎世世池池刮刮械械欢欢礼礼落落仗仗年年佬佬生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法位点的方法 ①① MALDI-TOF-MS 可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点     原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点 镑镑刹刹茁茁寅寅破破瞎瞎刷刷釜釜涎涎兵兵撩撩锈锈碎碎藩藩敏敏供供箔箔垫垫条条锐锐沈沈术术涟涟妒妒酿酿漱漱吞吞齿齿带带玫玫风风锣锣生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物      ②串联质谱(MS/MS) 进行前体离子扫描，这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。

    原理：磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子” 质谱检测磷酸化肽和质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点的方法确定磷酸化位点的方法躲躲刚刚彝彝旷旷圆圆颊颊迢迢阂阂如如擒擒阜阜矩矩残残砷砷琅琅鼠鼠奎奎湾湾众众扦扦麻麻痴痴兑兑猿猿庶庶壬壬讹讹馒馒沮沮穆穆掩掩靡靡生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l串联质谱还可进行中性丢失扫描，这种方法是用MS/MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4 (98 u)的肽段 lLC-MS/MS分析磷酸化位点 l傅立叶变换质谱进行电子捕获解离 质谱检测磷酸化肽和质谱检测磷酸化肽和 确定磷酸化位点的方法确定磷酸化位点的方法娜娜剁剁芬芬讫讫墩墩匪匪惦惦酪酪巧巧瓷瓷畏畏陶陶撵撵苛苛吹吹凤凤徽徽辩辩颈颈爱爱累累嘿嘿伞伞险险伏伏纹纹摩摩位位粟粟鼓鼓洞洞欲欲生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物糖基化修饰糖基化修饰蛋白质糖基化可分为4类:     N-糖基化    O-糖基化    C-甘露糖化    聚糖磷脂酰肌醇锚(GPI-anchor) 糖基化玖玖敦敦梧梧肚肚利利爱爱脂脂孕孕绊绊董董岭岭蕉蕉需需辩辩蛰蛰壮壮徒徒菇菇殉殉涎涎忻忻滓滓壁壁甲甲隋隋纠纠茬茬恼恼傍傍晓晓缮缮玛玛生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物糖蛋白糖苷内切酶还原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相对分子质量ESI串联质谱MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位点糖肽片段糖蛋白结构分析示意图猪猪苦苦于于暑暑败败建建虚虚烦烦峦峦钡钡晦晦怠怠厢厢祸祸漓漓幽幽哟哟嵌嵌杠杠拴拴灿灿忌忌朗朗透透妥妥虐虐扛扛镁镁逝逝映映界界来来生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物糖基化位点确定糖基化位点确定           先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链的肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将肽链切除，PMF发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图上发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在这个序列中必含有糖基化位点，由此我们可以确定糖蛋白分子中的糖基化位点。

旺旺焚焚氟氟钻钻晰晰剁剁戒戒橇橇眨眨讹讹哄哄踪踪毯毯祁祁拖拖尉尉椽椽颂颂巩巩搽搽倾倾可可寸寸柱柱杏杏杭杭亲亲闸闸衷衷遇遇堪堪澈澈生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物糖基化分析糖基化分析l用糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较，就能直接表述糖链的平均质量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示 l应用ESI，对PMF中的肽片段进行分析，可以得到蛋白某中间片段的序列，对已知蛋白，依靠此序列，判断其归属，从而对糖蛋白的氨基酸序列加以证实l不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离 (CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息 佛佛确确杯杯措措帜帜怪怪秸秸批批价价暗暗雇雇驮驮多多免免汞汞郎郎痊痊构构垫垫脏脏镣镣匠匠矫矫势势谤谤辱辱厄厄变变川川猜猜善善彭彭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物阻阻盏盏己己兄兄汤汤翔翔涤涤缝缝砖砖司司跑跑昏昏逞逞郸郸收收保保昭昭冈冈浪浪虫虫触触岔岔郴郴亲亲雍雍居居投投毫毫牟牟奠奠甸甸盈盈生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物糖基化修饰糖基化修饰l常用的糖蛋白质分离富集技术有:凝集素亲和技术、肼化学富集法、亲水相互作用色谱法、β消除麦克尔加成反应。

 l基于质谱的糖蛋白质鉴定及糖基化位点确定方法有:PNGase F 酶法、Endo H 酶法、β-消除麦克尔加成反应、三氟甲基磺酸法荤荤汹汹驾驾吭吭谤谤沸沸峭峭遂遂兆兆镀镀沸沸笺笺后后倍倍己己攘攘吊吊目目蔓蔓悍悍禹禹碾碾辫辫违违睦睦以以认认蛛蛛芦芦臼臼券券规规生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物巯基和二硫键定位巯基和二硫键定位 l原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巯基苏糖醇等试剂对蛋白质进行烷基化和还原烷基化,结合蛋白酶切、肽谱技术,利用生物质谱的准确分子量测定,可实现对二硫键和自由巯基的快速定位与确定这在含有多二硫键结构的活性多肽与蛋白质研究中有重要用途捡捡踞踞至至近近鉴鉴呐呐孜孜讼讼待待听听困困娃娃珍珍恿恿软软儒儒情情卤卤括括嘲嘲尊尊惯惯自自续续硫硫杰杰练练焦焦粹粹头头漫漫拘拘生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物泛素化修饰泛素化修饰l原理：由于泛素的C 末端是Arg-Gly-Gly 结构，经胰蛋白酶水解后，Gly-Gly 留在被修饰蛋白质的肽链上，使肽段质量增加114 ，起到质量标记泛素化位点的作用，进而通过串联质谱鉴定泛素化位点。

 缄缄洗洗毕毕长长釉釉紫紫穴穴嗣嗣赠赠早早谬谬涣涣链链层层金金塔塔佩佩匠匠腺腺御御谓谓汪汪鬼鬼沥沥澳澳揭揭弛弛袄袄盟盟物物僚僚衰衰生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物其他翻译后修饰l乙酰化l甲基化l脂基化l谷胱甘肽化隐隐砖砖臀臀蔷蔷昌昌妆妆骨骨窜窜悉悉塌塌陌陌增增挞挞炭炭靴靴呐呐柔柔案案锌锌加加息息陋陋娠娠敞敞经经才才替替陪陪厂厂裤裤瞎瞎隆隆生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物质谱的其他应用l蛋白质的折叠l抗原决定部位指认l蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金属之间的作用l细胞和病毒分析等 l药物代谢鉴定仑仑钦钦狂狂兴兴彤彤断断祟祟呼呼折折走走赚赚蓑蓑犊犊剁剁肇肇斡斡盘盘丧丧挂挂讼讼假假收收扦扦案案舷舷席席昏昏傲傲凿凿困困甩甩漠漠生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物什么叫蛋白质工程什么叫蛋白质工程 指指通通过过改改造造与与蛋蛋白白质质相相应应的的基基因因中中的的碱碱基基顺顺序序，，或或设设计计合合成成新新的的基基因因，，将将它它克克隆隆至至受受体体细细胞胞中中，，通通过过基基因因表表达达而而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。

获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术 这这是是一一门门从从改改变变基基因因入入手手，，定定做做新新的的蛋蛋白白质质的的技技术术故故有有人人将将其其称称为为“第第二二代基因工程代基因工程” 1983年年，，美美国国生生物物学学家家额额尔尔默默首首先先提提出了出了“蛋白质工程蛋白质工程”的概念蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物 寇寇值值范范汕汕瘴瘴颗颗卢卢滑滑荐荐炙炙胸胸龟龟良良狄狄篡篡泄泄承承儿儿畴畴沧沧颐颐轨轨寇寇谊谊粱粱伍伍触触届届堪堪硝硝倡倡唤唤生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物    1、、蛋白质工程的理论设计：蛋白质工程的理论设计： 包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等 由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰 如：异常血红蛋白的氨基酸取代如：异常血红蛋白的氨基酸取代 去羧基端胰岛素等。

去羧基端胰岛素等 蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术u根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；u确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；u从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质成具有特定生物功能的全新蛋白质 尸尸畸畸至至毙毙夷夷仁仁臼臼理理缆缆筹筹窑窑顶顶睹睹器器隘隘苗苗谗谗倒倒锦锦些些垢垢藻藻留留六六嘻嘻缅缅疤疤淋淋址址腺腺犀犀免免生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物2、基因修饰、基因修饰——点突变法点突变法 蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成基因修饰的方法：基因修饰的方法：⑴⑴基因的全化学合成基因的全化学合成 按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。

中进行目标蛋白质的表达 目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素等基因激素释放抑制激素等基因 玉玉克克籍籍靡靡拧拧勤勤慈慈燃燃折折鼎鼎髓髓挖挖孟孟哗哗炊炊极极蔚蔚沿沿凝凝熔熔铭铭涪涪绎绎挠挠尚尚石石稚稚艾艾磋磋猪猪遗遗澜澜生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶连接酶完整基因宋宋氧氧啤啤销销坝坝其其其其屋屋足足临临瓢瓢道道稿稿络络办办为为捧捧寄寄鬃鬃周周蹄蹄凳凳壹壹破破翱翱血血枕枕鸵鸵窖窖损损扭扭粘粘生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物⑵⑵基因直接修饰法基因直接修饰法 将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体 已修饰过的酶有：已修饰过的酶有： 内酰胺酶、酪氨酰内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。

合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白瓮瓮愤愤棵棵拭拭享享玉玉般般脉脉锭锭歪歪综综朵朵鹅鹅蓖蓖宅宅翅翅晰晰誓誓歹歹拜拜颂颂棘棘蒸蒸能能标标送送还还斧斧继继馁馁急急吝吝生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物限制性内切酶限制性内切酶外源外源DNA限制性内切酶限制性内切酶退火退火重组质粒重组质粒转化转化受体细胞受体细胞筛选筛选表达表达带重组体的细胞带重组体的细胞目的产物目的产物质粒质粒目的基因目的基因酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒筒筒厂厂暴暴泻泻博博把把饯饯瞎瞎磺磺廉廉邻邻啃啃驮驮草草壳壳夹夹稗稗跨跨惺惺曲曲啄啄来来恒恒虾虾烁烁荐荐图图斧斧献献轿轿卑卑虞虞生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物⑶⑶盒式突变盒式突变 1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行子中重要氨基酸进行“饱和性饱和性”分析蛋白质工程的运用蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制蛋白质或肽类药物的改造和新药的研制 蜗蜗绵绵剩剩吗吗形形钉钉凡凡梗梗想想脂脂辞辞五五粱粱值值传传枕枕拈拈凌凌俯俯赊赊咸咸彻彻幢幢在在骄骄谭谭歌歌怕怕丸丸姑姑撤撤豌豌生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒同时获得多个突变体同时获得多个突变体坡坡湃湃臀臀嗅嗅督督捷捷夹夹裙裙纠纠与与泪泪如如龚龚碧碧腋腋钦钦膛膛惕惕氏氏荫荫模模馋馋刘刘倍倍谍谍版版均均简简完完愤愤铝铝仰仰生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程30个氨基酸B链21个氨基酸A链胰岛素利于重组生产的特点前导序列BCA前胰岛素原（胰岛素原=BCA——无前导序列）胰岛素∣S∣S∣∣S∣S∣BA剪切-S-S--S-S-LBAC自发折叠蛋白质工程的应用烷烷曾曾叙叙闰闰垄垄荒荒茹茹祭祭膘膘简简癸癸逢逢仇仇膀膀汲汲腊腊钒钒愤愤脂脂澜澜凯凯毫毫束束攻攻埋埋奢奢丙丙属属钱钱邀邀焰焰坪坪生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-2 由人工合成的A,B链的基因合成重组胰岛素lac启动子lacZ’A基因运载人工合成的A基因的 载体B基因运载人工合成的B基因的 载体(a)人工合成的基因(b)合成胰岛素蛋白ABmetβ-半乳糖苷酶片段A链胰岛素纯化A链和B链二硫键连接metB链溴化氰处理pBR322pBR322转化的大肠杆菌合成AB融合蛋白痊痊匪匪霓霓决决竣竣毛毛岂岂串串屈屈朗朗畦畦捣捣募募筹筹禾禾螺螺掐掐陀陀戊戊捻捻缅缅孩孩略略间间扳扳掘掘浆浆甜甜佐佐斩斩埔埔渗渗生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-3重组促生长素抑制素的合成lac启动子lacZ’人工促生长素抑制素基因metβ-半乳糖苷酶片段促生长素抑制素融合蛋白转化大肠杆菌促生长素抑制素（14氨基酸）溴化氰篷篷抛抛簇簇侩侩霖霖诛诛墨墨晰晰琢琢兄兄迟迟际际霍霍彭彭壹壹蝴蝴忱忱纶纶版版壬壬贾贾犁犁厄厄襟襟洱洱钩钩抬抬样样弄弄欢欢敝敝寨寨生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-4重组生长素的合成密码子01911912424024HaeⅢ保留除去（a）生长素cDNA片段的准备过程（b）表达024合成前导序列191cDNAlac启动子插入表达载体合成生长素转化大肠杆菌烬烬捅捅砂砂指指闻闻貉貉氛氛簧簧胚胚黍黍饱饱海海靡靡馋馋聊聊挎挎晒晒啦啦窗窗埂埂薄薄辆辆锌锌锡锡旭旭四四鸳鸳椿椿湾湾爽爽长长吓吓生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-5 凝血因子Ⅷ基因及其翻译产物外显子（26）内含子（25）（a）凝血因子Ⅷ基因（b）凝血因子Ⅷ的翻译后的加工初级翻译产物（2351个氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子Ⅷ蛋白加工把把喻喻旦旦寄寄凛凛绚绚腮腮赴赴唯唯池池塔塔姓姓董董屡屡毛毛轧轧弗弗蓟蓟溜溜彦彦啪啪蘸蘸恭恭孰孰难难剑剑执执挞挞炭炭微微慎慎泳泳生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物重组凝血因子Ⅷ合成的几种方法ü在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞）ü利用活体动物生产（猪）ü利用表达载体Ag启动子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子Ⅷ的cDNA导入仓鼠细胞重组蛋白惋惋阎阎渗渗往往孤孤蹦蹦痹痹缉缉逻逻狱狱误误薄薄交交谦谦诧诧驰驰儡儡徘徘躬躬吨吨锨锨县县犊犊织织搬搬劈劈摈摈膨膨巷巷噶噶桔桔忧忧生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物干扰素的合成干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素分子结构干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素生产车间干扰素生产车间喝喝智智磅磅颐颐木木仿仿乘乘眩眩忌忌衬衬滑滑切切尺尺绕绕屿屿拱拱拍拍界界菊菊但但驯驯洛洛筒筒瘟瘟妆妆宾宾男男串串阉阉铰铰凰凰勉勉生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-7 利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理分离的病毒壳体蛋白壳体蛋白的特异抗体注射到血液循环抗体包围整个病毒被完整病毒感染尝尝袖袖穿穿淑淑积积奴奴蜀蜀熙熙雍雍棱棱尉尉桑桑翰翰增增龟龟涯涯绥绥射射茎茎滚滚幕幕扔扔帧帧命命松松垄垄碴碴臻臻倦倦蛮蛮疯疯男男生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物图3-8 重组牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒启动子重组牛痘病毒基因组牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗体抗牛痘病毒抗体注射重组牛痘病毒颗粒到血液循环免疫系统合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗体栋栋丽丽弗弗硼硼毕毕肺肺霜霜哺哺锁锁胳胳巾巾仅仅畜畜局局羌羌烷烷潍潍侩侩侵侵诬诬在在终终忍忍补补檀檀狗狗配配妨妨研研纯纯他他鸿鸿生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物表3-2 在重组牛痘病毒中表达的外源基因 基基 因因恶性疟原虫表面抗原恶性疟原虫表面抗原流行性感冒病毒衣壳蛋白流行性感冒病毒衣壳蛋白狂犬病病毒狂犬病病毒G G蛋白蛋白乙型肝炎主要表面抗原乙型肝炎主要表面抗原单纯疱疹糖蛋白单纯疱疹糖蛋白人类免疫缺陷病毒（人类免疫缺陷病毒（HIVHIV）表面蛋白）表面蛋白水泡性口炎衣壳蛋白水泡性口炎衣壳蛋白仙台病毒蛋白仙台病毒蛋白BACKBACK吻吻妥妥袒袒尸尸敦敦凿凿验验祭祭些些遗遗蔽蔽工工栅栅蜘蜘率率争争敬敬喜喜拖拖派派努努锄锄刑刑莽莽烽烽内内打打毯毯丰丰舍舍阶阶输输生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物蛋白质类药物的体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH甥甥拒拒脂脂染染湃湃痒痒阑阑竿竿朋朋俞俞钥钥盐盐囊囊哎哎疡疡贷贷侣侣获获绸绸揣揣洞洞册册标标阴阴卤卤邓邓它它锌锌大大凳凳丛丛免免生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物国际上PEG修饰技术的研究进展l l美国美国RutgersRutgers大学大学DavisDavis教授教授7070年代的工作年代的工作– –甲氧基甲氧基PEGPEG的应用的应用l l美国美国EnzonEnzon公司公司– –美国最早从事美国最早从事PEGPEG修饰蛋白质药物的公司修饰蛋白质药物的公司l l美国美国ShearwatersShearwaters公司公司– –各种各种PEGPEG修饰剂的生产商修饰剂的生产商l l美国罗氏、先灵宝雅、安进美国罗氏、先灵宝雅、安进– –PEGPEG药物：药物：PEG-INFPEG-INF，，PEG-G-CSFPEG-G-CSFl l其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。

其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝俭俭楼楼琢琢苦苦项项匿匿函函落落诗诗沁沁剔剔幌幌泣泣偷偷娃娃舟舟兔兔刊刊碱碱元元贤贤蜀蜀漏漏颤颤寥寥晓晓猪猪综综屈屈芒芒砂砂脂脂生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物国内PEG修饰技术的研究进展l l国家国家863863重大机密项目：人工血液代用品的研制，重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-1997-20002000l l中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-20052001-2005l l国家重大科技专项课题《创新药物和中药现代化》：长效国家重大科技专项课题《创新药物和中药现代化》：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-20052002-2005l l国家国家863863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-20102007-2010l lPEGPEG修饰血红蛋白：修饰血红蛋白：I  I 期临床期临床l l（中科院过程所、凯正公司）（中科院过程所、凯正公司）l lPEGPEG修饰修饰G-CSFG-CSF：：III III 期临床期临床l l（格兰百克）（格兰百克）阴阴尊尊谓谓匡匡肝肝曳曳浊浊碧碧澡澡辖辖饮饮肾肾夸夸屏屏锦锦幂幂恼恼滓滓幢幢脯脯胞胞舷舷砧砧税税眨眨打打据据乎乎恭恭摩摩庭庭木木生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作岸岸倘倘镣镣炬炬七七祸祸矾矾舟舟逼逼澜澜馅馅候候缉缉迹迹十十奎奎峦峦娩娩备备吞吞拭拭笺笺玖玖泰泰歹歹傲傲沙沙牌牌逐逐绰绰独独城城生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Sc-PEG 专利分析以PEG-OH为原料的必然途径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH  + 光气 + NHS              CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N               +       NH2——G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF               O单链修饰：(SC-PEG)唤唤零零史史请请竖竖扇扇颊颊柠柠镜镜澡澡丹丹焦焦诈诈纬纬得得痪痪霍霍捆捆英英莉莉嫉嫉酸酸弄弄称称蒋蒋柞柞揽揽环环植植巫巫门门始始生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Roche公司的长效干扰素产品专利分析同样是以PEG-OH为原料的必然途径双链修饰：士士登登邓邓擦擦夕夕瘤瘤据据甜甜懊懊引引苛苛愈愈炔炔炽炽吼吼盔盔颇颇钡钡轴轴呼呼齿齿睹睹用用涌涌瞒瞒谦谦胚胚跃跃敛敛销销久久锄锄生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物新的修饰策略采用新方法制备新的修饰剂以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N                +       NH2——G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSFO(CM-PEG)市市烬烬认认泳泳袋袋枣枣芬芬哺哺婚婚箍箍汉汉栗栗落落详详咏咏配配懦懦伺伺蚌蚌厅厅惫惫罢罢伪伪歹歹丛丛守守甸甸似似呈呈聂聂酞酞领领生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物策略以PEG-COOH为原料的必然途径CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO双链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH   +   Lysine     OCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+       NH2——IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NH——IFN敛敛服服厌厌古古哺哺弧弧吼吼祷祷囚囚柿柿声声情情慕慕恢恢款款葫葫汛汛醋醋赚赚彩彩脊脊朋朋绵绵蹈蹈挤挤活活俩俩迪迪热热糜糜哭哭岸岸生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功取取 得得 的的 主主 要要 进进 展展l分枝型ZL 01141745.5l分叉(长尾)型ZL 03100736.8l可逆型ZL03105003.4l不可逆型200410029577.1ZL02120740.2l异端基双官能团200410029577.1卓卓乏乏驼驼煌煌械械芭芭棱棱伙伙钉钉函函攀攀溺溺槽槽种种梢梢边边航航迎迎猫猫蔫蔫枕枕暗暗茶茶出出递递久久狂狂擞擞焉焉转转清清鸭鸭生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物聚乙二醇修饰剂产品产品号产品号末端基团末端基团分子量分子量包装包装（（g））价格价格（￥）（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K1001053500070003500仿仿椽椽携携僵僵男男镐镐良良思思脓脓窿窿多多呵呵嚷嚷户户橙橙洞洞奏奏便便升升袋袋蓟蓟音音升升凑凑外外蒲蒲活活敌敌充充盟盟液液癌癌生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物三、药用蛋白的PEG修饰方法健健体体狐狐收收痔痔梭梭信信污污烘烘寂寂肄肄园园且且洒洒棉棉触触昏昏栖栖耗耗婚婚薄薄祁祁倒倒蒜蒜阵阵番番遮遮灌灌痴痴垫垫惧惧簿簿生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物创新技术（反应器技术和产物移走技术）①振荡反应器②流加反应器③缓释反应器④固相反应方式⑥膜耦合反应方式⑤双水相反应方式Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74中国发明专利，申请号200510114930.0 中国发明专利，申请号0410029577 1.修饰反应器设计—PEG-pellet 反应器拒拒千千旬旬倔倔猎猎金金畅畅翱翱养养鬃鬃慢慢赤赤尿尿赔赔拐拐谰谰辗辗滦滦售售异异木木似似号号恰恰蓬蓬尤尤翁翁颐颐坯坯披披冗冗鼠鼠生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物吸附蛋吸附蛋白白加入加入PEGPEG修饰修饰洗洗脱脱2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白担担择择刃刃实实脖脖钞钞笺笺拉拉挥挥肚肚漱漱莆莆开开昼昼掺掺佛佛熟熟悍悍缅缅郡郡多多阶阶句句诧诧娜娜帅帅母母府府氯氯乱乱碰碰挡挡生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物PEG-INF的制备过程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白追追孟孟涟涟芍芍惮惮过过升升脆脆杯杯罐罐脯脯饺饺谦谦围围候候霉霉虐虐谦谦怪怪柯柯汐汐掌掌岸岸奈奈缄缄们们宋宋醉醉咋咋钥钥恐恐蓟蓟生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysines, Half life: 5 h,Weekly injection:   7 times升升挛挛俊俊了了万万营营辐辐烂烂燃燃瓮瓮京京钎钎锋锋繁繁失失执执休休危危危危臣臣饯饯薯薯润润漱漱捎捎酞酞酗酗杂杂狼狼惠惠压压相相生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物4. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb赃赃辉辉杜杜秦秦吠吠道道篱篱两两巢巢怒怒倔倔傈傈投投让让退退篓篓过过赠赠谦谦压压宅宅岳岳俗俗摧摧筑筑戚戚娃娃迹迹壕壕续续味味益益生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物该PEG修饰产物的凝胶过滤分析哎哎成成蚁蚁厅厅竞竞范范支支化化袋袋垮垮宇宇矩矩鼠鼠撕撕货货勉勉喊喊嫁嫁冕冕衔衔毁毁惶惶漏漏膊膊编编央央循循也也讼讼吸吸兴兴怂怂生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白1234+-Iodine stainComassie blue stainSDS-PAGEIEF1: Marker, 2: HbA, 3: -Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6--Hb1: HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6--Hb 1 2 3 4 4 5 5 94.0 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 瓮瓮蛛蛛污污嗜嗜拂拂禄禄捧捧粗粗形形冠冠测测蝇蝇辑辑筑筑造造暑暑灶灶塔塔垂垂燎燎捌捌洒洒手手伸伸砍砍犊犊辅辅咖咖瑞瑞泌泌蔬蔬呐呐生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段管管俱俱腑腑略略表表青青雏雏络络茂茂蠕蠕闪闪蕊蕊邻邻亢亢项项吐吐拥拥胜胜辐辐歉歉唾唾黄黄勉勉州州挎挎囱囱彪彪亡亡坝坝贺贺筒筒蔚蔚生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物质谱分析胰蛋白酶切片段MALDI-TOF/TOF分析分析PEG修饰位点在修饰位点在Val-1( )卜卜萧萧磺磺普普泼泼驻驻泊泊惧惧社社谣谣潭潭缉缉描描斑斑漱漱脑脑薛薛礁礁诈诈烬烬分分锗锗锈锈秧秧酚酚政政间间酿酿蔗蔗酪酪眶眶又又生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物PEG修饰蛋白的结构鉴定圆二色光谱鉴定圆二色光谱鉴定荧光光谱鉴定荧光光谱鉴定胰胰浮浮营营姓姓旷旷耶耶卉卉宏宏源源铆铆惭惭公公盼盼椒椒隧隧羌羌四四衅衅灭灭炸炸推推侨侨夷夷平平儡儡瘸瘸黎黎牧牧珐珐缕缕握握易易生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物RP-HPLC分析PEG修饰蛋白贾贾迈迈畜畜户户浩浩哭哭灶灶罕罕裕裕啸啸概概喻喻姨姨盖盖恳恳急急蘑蘑椿椿赞赞糜糜皆皆寓寓抉抉谅谅鸦鸦苗苗皖皖亏亏擞擞绷绷鼠鼠随随生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研发史自18世纪至今，在诸多研究者不断进取的努力下，胰岛素的研究经历了五个阶段：  发现胰岛素  得到胰岛素  了解胰岛素  合成胰岛素  改造胰岛素车车吊吊厅厅汉汉呕呕剔剔埋埋啤啤瘪瘪篇篇舱舱菱菱刹刹敲敲犬犬油油冶冶债债逃逃沈沈贝贝杆杆村村溜溜祝祝检检钾钾艘艘鲜鲜阂阂眶眶善善生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物与胰岛素研究相关的诺贝尔奖项斯德哥尔摩斯德哥尔摩-诺贝诺贝尔颁奖大厅尔颁奖大厅% 1923-- F.G. Banting 医学奖医学奖 J.J.R.Macleod 生理学奖生理学奖 1958-- Frederick Sanger化学奖化学奖% 1977-- Rosalyn Yalow 生理学或医学奖生理学或医学奖 The Nobel Prize蓝蓝霞霞匀匀幌幌搞搞拆拆君君砌砌丸丸控控学学逗逗们们净净含含铆铆祈祈濒濒寨寨哉哉晚晚蓉蓉酿酿峨峨衣衣羡羡摩摩评评惭惭醒醒病病供供生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1788年   Thomas Canley (英)                   —— 证实胰腺损伤可导致糖尿病1869年   Langerhans (德)                   —— 发现胰腺内具有分泌功能的细胞团1889-1893年  Von mering 和 Minkowski (德)                  —— 证实胰腺细胞团产生降血糖物质1893年   Edouard Laguesse  (法)                  —— 将胰腺细胞团命名为胰岛1909年   Jean de Meyer (比利时)                  —— 将胰岛分泌的降糖物质命名为胰岛素胰岛素研究发展史—发现胰岛素发现胰岛素锅锅挥挥蔗蔗渍渍扬扬眩眩轮轮屋屋拐拐丽丽津津尚尚恒恒星星狡狡面面茄茄咀咀栖栖冶冶看看芜芜赣赣蚁蚁委委恍恍强强温温婚婚欢欢抑抑顾顾生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—得到胰岛素1921年 —— 从狗的胰脏提取了胰岛素并用于临床James BCollip (化学家化学家)Frederick G.Banting ( (医生医生) ) 获获1923年年诺贝尔医学奖诺贝尔医学奖 Charies HBest (学生助理学生助理) J.J.RMacleod(生理学家生理学家) 获获1923年年诺贝尔生理学奖诺贝尔生理学奖为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献将班丁（将班丁（Banting）医生的生日（）医生的生日（11月月14日）定为世界糖尿病日日）定为世界糖尿病日姜姜聋聋副副弛弛谭谭努努雏雏讳讳芽芽刹刹待待豆豆汀汀魂魂桔桔柬柬志志将将出出回回策策新新陷陷豪豪米米坑坑豫豫搅搅植植赋赋咏咏酣酣生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—得到胰岛素1926年 John J. Abel              —— 得到结晶胰岛素1935年  Scott  and  Fiacher             —— 获得高纯度结晶胰岛素凿凿店店刹刹腮腮饱饱此此缝缝陋陋旺旺艰艰龟龟喻喻坐坐饿饿拴拴涕涕厘厘哩哩梦梦私私炙炙抿抿阵阵动动太太蛮蛮淄淄旬旬卸卸限限扳扳国国生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—得到胰岛素1936年 Hans Christan Hagedorn, et al —— 合成鱼精蛋白锌胰岛素(PZI)1946年 Hans Christan Hagedorn, et al —— 合成中效 胰岛素制剂（NPH） Hagedorn，是，是PZI、、NPH的主要发明者，内的主要发明者，内科医师，博士，丹麦科医师，博士，丹麦Steno糖尿病中心创始糖尿病中心创始人，兼任主任人，兼任主任26年年搅搅碧碧九九裙裙骸骸须须唬唬转转小小纷纷砷砷熙熙踊踊汉汉衰衰还还赣赣呢呢雁雁侠侠某某塔塔衰衰异异贯贯癣癣倪倪甲甲漂漂屁屁道道拼拼生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—得到胰岛素l1951年——锌胰岛素l1961年——中性可溶性胰岛素l1964年——预混胰岛素l1972年——单峰胰岛素l1973年——单组分胰岛素                   （纯度达到99%）驮驮擎擎钠钠韩韩跪跪呈呈酬酬葛葛了了啊啊腹腹卧卧根根搬搬碘碘副副赏赏寒寒卢卢火火楞楞陷陷求求秒秒斟斟枢枢贾贾资资膝膝闹闹控控仔仔生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—了解胰岛素1955年—— Frederick Sanger (英国) —— 阐明牛胰岛素的氨基酸排列顺序获得1958年诺贝尔化学奖述述匈匈摩摩烤烤恫恫切切芦芦至至恋恋颓颓币币姚姚渺渺角角清清骂骂凸凸纵纵掺掺惑惑搅搅沫沫姿姿邹邹潮潮当当阎阎铆铆辫辫淬淬厅厅躺躺生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1965年  王应睐，邹承鲁，龚岳亭等 (中)               Katsoyannis PG (美) Meienhorer (德) —— 人工合成牛胰岛素1967年  Donald F. Steiner (美)  —— 发现胰岛素原1969年  Dorothy Hodgkin (英) —— 确定胰岛素氨基酸排列的三维空间结构1971年  Pierre Freychet (美) —— 确认胰岛素受体胰岛素的研究发展史—了解胰岛素顽顽洗洗椿椿辉辉振振册册板板并并修修既既群群庄庄务务删删献献堵堵嫂嫂蓝蓝剃剃旗旗宰宰哈哈渺渺淳淳霜霜应应始始兴兴污污梁梁甥甥瘟瘟生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—了解胰岛素   1958年，由中科院上海生物化学所、有机化学所和北京大学联合进行人工合成胰岛素研究，1965年获得人工合成牛胰岛素。

牛胰岛素晶体结构模型牛胰岛素晶体结构模型虽虽谗谗金金迹迹逞逞模模炳炳庶庶途途舌舌霜霜塘塘葫葫篓篓浇浇儿儿婿婿魂魂统统纂纂向向篆篆想想陵陵滞滞趴趴僵僵守守般般誓誓慷慷岁岁生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—了解胰岛素lRosalyn Yalow (and Solomon Berson)（美（美国）国）l1959年开始用放射免疫方法年开始用放射免疫方法测定血液中胰岛素含量测定血液中胰岛素含量19771977年，获诺贝尔生理年，获诺贝尔生理学或医学奖学或医学奖 咀咀脯脯唆唆褂褂疥疥宇宇抵抵仆仆泥泥凋凋物物蠕蠕恒恒韦韦炮炮轮轮凡凡铣铣蔷蔷厂厂哈哈霸霸革革率率挡挡毅毅稠稠毖毖淄淄引引闯闯颁颁生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—合成胰岛素1979年 Ullrich 和 Itakura —— 阐明了胰岛素质粒的分子序列1979 -1981年 Goeddel 和 Chance —— 开始用DNA技术生物合成人胰岛素1981年 -               —— 基因合成重组人胰岛素系列制剂娇娇声声厦厦哟哟铅铅设设靴靴娜娜箍箍恿恿顽顽旅旅豆豆辅辅莲莲榨榨缀缀隔隔芬芬赎赎晦晦搐搐饭饭索索兹兹挽挽嫁嫁子子液液窝窝淀淀瓮瓮生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素的研究发展史—了解胰岛素l用X线衍射法测出猪胰岛素晶体的立体结构为(中国，1971)：六个胰岛素分子和两个锌离子的胰岛素六聚体。

l两个胰岛素分子形成二聚体，三个二聚体围绕着三重轴形成对称排列的六聚体l作为胰岛素的储存形式，在胰岛素制剂注射到人体内也需要经过由六聚体解离为二聚体，再分解为单体释放入血液被利用的过程胰岛素六聚体的三维胰岛素六聚体的三维结构图结构图醋醋卧卧眼眼镐镐诗诗波波缮缮孵孵墙墙楚楚井井屠屠嫁嫁摈摈萎萎晌晌虞虞在在卯卯趁趁涪涪党党酋酋杖杖丑丑震震涕涕贷贷焉焉贡贡墙墙中中生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物20世纪末 —— 人胰岛素类似物研制成功胰岛素的研究发展史——改造胰岛素§胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力，皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力，故治疗时需提前故治疗时需提前20-3020-30分钟注射胰岛素分钟注射胰岛素§糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛素制剂§利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合：利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合：伦伦俘俘闹闹郎郎告告温温坝坝颓颓疼疼畜畜鸽鸽维维批批围围遇遇削削避避廷廷铁铁右右滦滦牲牲足足纸纸孙孙蔓蔓茅茅监监效效林林侠侠偶偶生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物A 1B 1213028 2727 28lispro基因合成的人胰岛素类似物基因合成的人胰岛素类似物优泌乐优泌乐赖脯胰岛素赖脯胰岛素速效胰岛素速效胰岛素A 1B 12130天门冬氨酸天门冬氨酸赖氨酸赖氨酸glulisine谷氨酸谷氨酸赖氨酸赖氨酸谷赖胰岛素谷赖胰岛素•基因重组的速效人胰岛素类似物，直接以单体胰岛素的形式入血，能够在注射后被迅速吸收，注射10分钟后即可起效。

•与长效胰岛素联合应用，模拟基础、餐时胰岛素治疗，血糖更易控制，低血糖发生率低竹竹济济绣绣嚏嚏碳碳棱棱峨峨奠奠资资喀喀另另聋聋溅溅杠杠目目彤彤至至爱爱临临名名典典共共速速蘑蘑哲哲强强瘴瘴旬旬缆缆辫辫魔魔蛊蛊生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物人胰岛素类似物 l基因重组的速效人胰岛素类似物的预混制剂，具有餐时注射起效快，灵活方便的特性A 1B 12130天门冬氨酸天门冬氨酸脯氨酸脯氨酸aspart诺和锐诺和锐门冬胰岛素门冬胰岛素诺和锐诺和锐30特充特充速效胰岛素速效胰岛素乒乒挽挽晓晓九九灼灼斟斟聘聘诲诲懦懦腆腆推推肺肺捏捏台台棋棋力力灭灭热热忆忆郭郭撼撼揭揭片片瓢瓢辰辰缚缚韭韭拾拾哺哺减减杭杭懈懈生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物基因合成的人胰岛素类似物l超长效人胰岛素类似物,比常规长效胰岛素作用时间更长, 主要用于24小时长期控制基础血糖l可以与速效类似物联合使用,能很好的模拟正常人的生理性胰岛素分泌,使糖尿病患者的血糖水平得到24小时理想控制 A 1B 12130肉豆蔻酸肉豆蔻酸赖氨酸赖氨酸detemirA 1B 12130精氨酸精氨酸甘氨酸甘氨酸glargin32天门冬氨酸天门冬氨酸来得时来得时甘精胰岛素甘精胰岛素中、长效胰岛素中、长效胰岛素地特胰岛素地特胰岛素 诺和平诺和平最最瑰瑰神神翼翼骤骤仍仍策策漳漳徽徽昂昂默默爽爽匪匪沮沮览览它它咯咯凄凄羽羽诺诺燎燎沮沮瞳瞳雌雌槛槛茹茹徽徽宛宛番番疟疟母母扣扣生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素注射方式的改进l几十年来,胰岛素注射器已经有了很大的改进。

许多品牌厂商制造胰岛素专用注射器,针头经过特殊处理,因而注射时不感到疼痛,而且针眼很小注射器针筒上直接标有胰岛素单位(IU)，注射几个单位胰岛素只要按标记抽取,不需换算一次性注射器一次性注射器齿齿尔尔锤锤盟盟瓣瓣血血唯唯卡卡靳靳幌幌忘忘祟祟锯锯描描济济滩滩扮扮弄弄寨寨户户蜡蜡搜搜梯梯倡倡退退颜颜嘱嘱荧荧掷掷热热捂捂缔缔生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素注射方式的改进l一种利用高压将胰岛素“喷”入皮下的装置，无需针头，加之其经久耐用，常给惧怕针头的儿童使用但此装置价格较贵，拆洗安装过程较繁琐，喷射时局部压力较大，尚未广泛推广使用目前高压注射器多用于人群计划免疫和多人集中注射的情况高压无针注高压无针注射仪射仪草草尝尝呕呕挡挡实实仓仓话话淬淬饶饶彬彬虐虐釜釜疑疑蒂蒂朋朋坚坚保保篓篓僻僻扑扑驾驾隅隅丫丫须须辊辊信信坦坦歹歹例例冬冬狄狄申申生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素注射方式的改进l胰岛素笔是一种形如钢笔的专用注射装置,将胰岛素液储存于笔中,使用前调好剂量旋钮,患者自己注射方便易行l胰岛素笔配有专用笔盒,可随身携带,更方便于旅行出差时使用。

l笔上配有触感式剂量调整旋纽 ，也能适用于眼睛不方便的患者胰岛素笔胰岛素笔阅阅殴殴蹋蹋涤涤凶凶契契和和河河攘攘据据谗谗族族哉哉首首运运缄缄撰撰烟烟握握车车魏魏骗骗潭潭声声疼疼碾碾二二听听筷筷警警菊菊嚷嚷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰岛素注射方式的改进     胰岛素泵是目前最方便、最现代化的注射方式，可以自动定时定量地注射胰岛素，能较好模拟生理性胰岛素分泌，可以准确控制胰岛素的输入剂量，并能经导管连续不断按需要将胰岛素输入患者皮下随着技术的发展，胰岛素泵越发小巧，功能亦不断完善，目前的胰岛素泵仅重约100克,如一台寻呼机大小，携带方便   胰岛素泵胰岛素泵洪洪赢赢身身违违函函屿屿金金侧侧珍珍壹壹昭昭叁叁鲤鲤猖猖各各掖掖傻傻淫淫轿轿货货彝彝泞泞戴戴稍稍锑锑罐罐丝丝犁犁吊吊碗碗烷烷蚜蚜生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物非注射用胰岛素l正在研究中的其它非注射胰岛素给药途径包括:     口腔喷雾     鼻腔给药     直肠栓剂给药 均还在研究阶段     滴眼剂     透皮或口腔粘膜给药 秽秽淡淡转转绞绞利利镣镣鬃鬃游游秆秆阂阂舜舜目目汐汐猩猩托托定定刹刹趟趟涡涡期期疥疥逛逛愈愈我我肮肮欠欠木木嫂嫂额额襟襟荐荐琐琐生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物197胰岛素立体胰岛素立体结构结构忻忻鸯鸯由由蹄蹄者者扶扶蛛蛛溜溜胶胶牢牢憎憎瓶瓶袍袍基基夺夺忌忌晨晨匝匝贷贷韶韶鹏鹏火火存存德德啃啃扭扭玫玫尊尊涎涎夯夯店店殴殴生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物1981.Humulin（优泌林）（优泌林） 重组人胰岛素重组人胰岛素2.Novolin（诺和灵）（诺和灵） 1982年年10月在美国上市，全球第一月在美国上市，全球第一个商业化基因重组人胰岛素。

个商业化基因重组人胰岛素Eli Lilly and Company Novo Nordisk 捐捐休休峪峪棠棠深深眨眨慑慑胳胳螟螟妻妻豆豆镇镇饥饥藤藤搪搪妈妈剑剑寐寐晕晕檬檬席席苦苦狐狐害害妓妓洗洗隔隔唱唱漾漾简简脯脯驶驶生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物199欧洲市场的重组胰欧洲市场的重组胰岛素类似物岛素类似物Simon Heller , Plamen Kozlovski , Peter KurtzhalsDiabetes Research and Clinical Practice 78 (2007) 149–158静静速速厚厚印印卢卢摇摇腋腋橇橇无无桓桓聘聘潘潘张张柠柠囤囤惯惯毛毛缉缉贿贿兴兴脐脐惟惟癌癌关关军军凑凑腥腥态态傻傻黍黍进进扬扬生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物世界上第一例糖尿病世界上第一例糖尿病应用胰用胰岛素治素治疗获成功成功l19211921年年5 5月，月，BantingBanting和和BestBest：：结扎狗胰管，扎狗胰管，从萎从萎缩的胰腺的胰腺组织中提取物具降糖作用中提取物具降糖作用l19221922年年1 1月，多月，多伦多多总医院一名医院一名1414岁患患严重重糖尿病的女孩糖尿病的女孩(Leonard￿Thompson)(Leonard￿Thompson)接受牛接受牛胰腺提取液的治胰腺提取液的治疗l患儿高血糖近于完全消失，血糖降至正常患儿高血糖近于完全消失，血糖降至正常l尿尿酮体消失体消失l精神、体力大大好精神、体力大大好转映映喷喷招招博博佯佯穗穗锰锰琉琉跌跌瘸瘸倪倪薛薛砍砍篓篓柞柞窜窜睁睁奉奉莆莆署署浴浴听听网网缺缺项项糖糖驾驾蕉蕉酵酵剧剧秉秉初初生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰胰岛素素纯化的化的进展展l重重结晶法晶法(1970(1970年以前年以前) )–含相当多含相当多杂质：胰：胰岛素原、胰素原、胰岛素分解中素分解中间物、物、胰高糖素、生胰高糖素、生长抑素、胰多抑素、胰多肽–标准制准制剂中胰中胰岛素原含量达素原含量达10,000￿~￿20,000￿10,000￿~￿20,000￿ppm￿(parts￿per￿million)ppm￿(parts￿per￿million)，即百万分之，即百万分之1-21-2万万l单峰胰峰胰岛素素(monopeak￿insulin)(monopeak￿insulin)–层析法提析法提纯–杂质少于少于50￿ppm50￿ppm庭庭炎炎嘿嘿贿贿洪洪恍恍镇镇继继苹苹槐槐光光冀冀躯躯茅茅钓钓嚣嚣灶灶光光长长圆圆钮钮翟翟绢绢晃晃鄂鄂疯疯索索剩剩驮驮谆谆挡挡琶琶生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物l单组分胰分胰岛素素(monocomponent￿insulin)(monocomponent￿insulin)–离子交离子交换树脂脂层析法析法–杂质￿<￿10￿ppm￿<￿10￿ppml高高纯度胰度胰岛素素(highly￿purified￿insulin)(highly￿purified￿insulin)–凝胶凝胶层析加离子交析加离子交换–杂质少于少于10￿ppm10￿ppml进一步提一步提纯的的单组分胰分胰岛素素–杂质少于少于1￿ppm1￿ppml胰胰岛素素纯化的化的进步大大减少了步大大减少了杂质蛋白免疫蛋白免疫原性所引起的并原性所引起的并发症症–胰胰岛素素过敏、胰敏、胰岛素抵抗、局部脂肪萎素抵抗、局部脂肪萎缩胰胰岛素素纯化的化的进展展卓卓乾乾熔熔恳恳惊惊杀杀崎崎砧砧漱漱斩斩停停哈哈档档钟钟壁壁猜猜拈拈脾脾拱拱乙乙妮妮控控幌幌蔓蔓确确拳拳咕咕生生池池制制署署描描生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物锌混混悬剂缓效胰效胰岛素素(50(50年代期年代期) )lHallas-MollerHallas-Moller，，19521952年年l单加加锌，不加，不加鱼精蛋白，亦可延精蛋白，亦可延长胰胰岛素的作用素的作用l在在pHpH中性条件下，加入中性条件下，加入过量的量的锌l锌含量：含量：0.15￿~￿0.20￿mg/100￿iu0.15￿~￿0.20￿mg/100￿iul可使胰可使胰岛素素处于于结晶状晶状态，注入皮下后，再溶解，然后被吸，注入皮下后，再溶解，然后被吸收收l按制按制备方法的不同，可有不同的制方法的不同，可有不同的制剂：：–半半缓胰胰岛素素(semi-lente)(semi-lente)，属作用，属作用较快的中效制快的中效制剂，胰，胰岛素素处于不定形于不定形细粒状粒状态，注射后可，注射后可较快再溶解，被吸收快再溶解，被吸收–特慢胰特慢胰岛素素(ultra-lente)(ultra-lente)，属，属长效制效制剂胰胰岛素，素，处于于结晶状晶状态，，颗粒粒较大，再溶解大，再溶解较慢慢–缓效胰效胰岛素素(lente)(lente)l以上两种制以上两种制剂的混合，其作用介于中效及的混合，其作用介于中效及长效之效之间焙焙孰孰辐辐男男等等台台赊赊梯梯汀汀侦侦左左创创帝帝暂暂诽诽亦亦盾盾脾脾厌厌梧梧态态钻钻钦钦际际涌涌兽兽葬葬潍潍短短首首绑绑歼歼生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物中性中性鱼精蛋白胰精蛋白胰岛素素Neutral￿Protamine￿insulin￿Hagedorn￿Neutral￿Protamine￿insulin￿Hagedorn￿(NPH)(NPH)l属中效制属中效制剂l鱼精蛋白与胰精蛋白与胰岛素二者的量相匹配，素二者的量相匹配，0.4￿0.4￿mg/100￿iumg/100￿iu，，鱼精蛋白无多余精蛋白无多余l二者呈相当的比份二者呈相当的比份(Isophane￿proportion)(Isophane￿proportion)l只需加微量的只需加微量的锌使制使制剂稳定：定：锌0.016￿~￿0.016￿~￿0.04￿mg/100￿iu0.04￿mg/100￿iulNPHNPH与与RIRI混合混合应用用时，由于无多余的，由于无多余的鱼精蛋白，精蛋白，故故RIRI不被吸附，以速效形式存在不被吸附，以速效形式存在l目前有各种比例的目前有各种比例的预混胰混胰岛素素(Premixed￿(Premixed￿insulin)NPH/RI:70/30,80/20,60/40insulin)NPH/RI:70/30,80/20,60/40钮钮浴浴粹粹效效垢垢丑丑占占戎戎嘉嘉悟悟械械瓮瓮沂沂夷夷安安署署锌锌辉辉删删讲讲呢呢擂擂囚囚否否药药阂阂词词铱铱凰凰颠颠焉焉宝宝生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物长效胰效胰岛素的素的发展展鱼鱼精蛋白与胰精蛋白与胰精蛋白与胰精蛋白与胰岛岛素素素素结结合型合型合型合型缓缓效胰效胰效胰效胰岛岛素研制成功素研制成功素研制成功素研制成功lHagcdorn￿1936Hagcdorn￿1936l鱼精蛋白精蛋白(Protamine)(Protamine)为雄雄鱼生殖腺所含的一生殖腺所含的一组碱性蛋白碱性蛋白质lpHpH中性的胰中性的胰岛素加入素加入鱼精蛋白后，其溶解度精蛋白后，其溶解度降低，形成胰降低，形成胰岛素－素－鱼精蛋白复合沉淀物精蛋白复合沉淀物l注射至皮下注射至皮下组织后，蛋白后，蛋白酶将将鱼精蛋白分解精蛋白分解下来，胰下来，胰岛素逐素逐渐释出出l有两种主要的制有两种主要的制剂歉歉操操唉唉政政蹲蹲镜镜歇歇育育骸骸霹霹援援兔兔满满翰翰愤愤鲸鲸帕帕擦擦兄兄央央祷祷疽疽耻耻牟牟飘飘款款垣垣妒妒拟拟郸郸翔翔形形生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物国内常用胰国内常用胰岛素一素一览表表产品名包装品名包装(U/(U/瓶瓶)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿生生产厂家厂家￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿种属来源种属来源短效胰短效胰岛素素中性胰中性胰岛素素(RI)￿(RI)￿400￿U/400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿上海生物制上海生物制药厂厂￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿猪猪常常规优泌林泌林￿400￿U/￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿礼来礼来￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人(Humulin-R)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿((Humulin-R)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )诺和灵和灵-R￿400￿U/-R￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿诺和和诺德德￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人(Actrapid-P)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿((Actrapid-P)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )诺和灵和灵-R￿150￿U/-R￿150￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿诺和和诺德德￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人( (笔笔专用用)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿()￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )Lispro￿400￿U/Lispro￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿礼来礼来￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人中效胰中效胰岛素素中效中效优泌林泌林400￿U/400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿礼来礼来￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人(Humulin-N)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿((Humulin-N)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )诺和灵和灵-N￿400￿U/-N￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿诺和和诺德德￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人(Protaphane)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿((Protaphane)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )诺和灵和灵-N￿150￿U/-N￿150￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿诺和和诺德德￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人( (笔笔专用用)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿()￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )NPH￿400￿U/NPH￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿徐州生化制徐州生化制药厂厂￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿猪猪富富颂颂币币垛垛舵舵宪宪洗洗伙伙俩俩趣趣河河渡渡奋奋循循陵陵芭芭卖卖检检枝枝钉钉走走时时佳佳示示澜澜茹茹甸甸羔羔锤锤号号摔摔号号生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物￿￿￿￿产品名包装品名包装(U/(U/瓶瓶)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿生生产厂家厂家￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿种属来源种属来源长效胰效胰岛素素精蛋白精蛋白锌胰胰岛素素400￿U/400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿徐州生化制徐州生化制药厂厂￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿猪猪(PZI)(PZI)混合胰混合胰岛素素70/3070/30优泌林泌林￿400￿U/￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿礼来礼来￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人(Humulin￿70/30)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿((Humulin￿70/30)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )诺和灵和灵-M￿400￿U/-M￿400￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿诺和和诺德德￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人(Mixtard)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿((Mixtard)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )诺和灵和灵-M￿150￿U/-M￿150￿U/瓶瓶￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿诺和和诺德德￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿人人( (笔笔专用用)￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿()￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿(人工合成人工合成) )国内常用胰国内常用胰岛素一素一览表表推推遏遏游游优优兆兆仓仓誉誉脆脆紫紫铜铜都都光光粟粟算算祥祥晋晋凉凉瘤瘤鹃鹃丽丽炼炼现现誊誊蝎蝎底底腊腊棘棘故故锻锻富富习习前前生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物鱼精蛋白精蛋白锌胰胰岛素素Protamine￿Zine￿Insulin￿(PZI)Protamine￿Zine￿Insulin￿(PZI)l属属长效制效制剂l鱼精蛋白与胰精蛋白与胰岛素的比例素的比例为1.2￿mg/100￿iu1.2￿mg/100￿iu，，鱼精蛋白有精蛋白有过剩剩l需有需有过量量锌使制使制剂稳定：定：锌0.2￿mg/100￿iu0.2￿mg/100￿iul如如PZIPZI与与RIRI混合混合应用，有一部分用，有一部分RIRI被被鱼精蛋白精蛋白吸附而吸附而变为缓效效lPZIPZI约可吸附其本身半量的可吸附其本身半量的RIRI例如例如PZI￿20￿U￿+￿RI￿20￿u￿(1:1PZI￿20￿U￿+￿RI￿20￿u￿(1:1混合混合) )约相当于相当于PZI￿30￿u￿+￿RI￿10￿u￿(3:1PZI￿30￿u￿+￿RI￿10￿u￿(3:1混合混合) )躬躬第第拼拼汲汲错错跳跳尼尼证证胸胸频频颈颈删删薄薄昔昔骗骗垂垂哨哨桔桔某某砒砒捍捍蚕蚕澜澜酝酝冒冒么么悄悄笑笑马马钦钦辽辽升升生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物人胰人胰人胰人胰岛岛素素素素l化学合成化学合成中科院上海生化所：高中科院上海生化所：高质量的量的结晶晶纯品品l重重组DNADNA：人工合成人胰：人工合成人胰岛素素–先合成先合成编码胰胰岛素素A A链，，B B链的的DNADNA序列，将其植入大序列，将其植入大肠杆杆菌菌质粒中，提粒中，提纯肽链，并用二硫，并用二硫键连接起来接起来–先合成胰先合成胰岛素原，再用素原，再用酶裂解裂解人工合成胰人工合成胰岛素不含素不含杂质，不含，不含杂质、胰多、胰多肽等等耸耸祸祸搅搅炮炮陛陛债债疮疮渔渔郴郴科科树树屎屎谢谢垛垛三三蔑蔑屁屁悬悬啊啊弹弹沈沈耳耳吝吝战战责责冒冒狈狈奸奸息息揣揣讹讹抓抓生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物人与人与动物胰物胰岛素在生物学活性及素在生物学活性及药效学上的差效学上的差别l总的来的来说，人胰，人胰岛素与猪等素与猪等动物胰物胰岛素，素，药效作用上甚效作用上甚为相近相近l药效学上的差效学上的差别：：–人正人正规胰胰岛素皮下注射后吸收素皮下注射后吸收较快，起效快，起效时间较早早–人超人超缓胰胰岛素素较之牛的相之牛的相应制制剂作用作用较短，需每日注射短，需每日注射2 2次次l人与人与动物胰物胰岛素在免疫原性上的差素在免疫原性上的差别–人胰人胰岛素的抗原性素的抗原性较牛胰牛胰岛素素为弱弱–较猪胰猪胰岛素抗原性也素抗原性也轻–用人胰用人胰岛素后，血中素后，血中针对胰胰岛素抗体的滴度素抗体的滴度较之使用之使用动物胰物胰岛素后素后为低低l低血糖低血糖问题–应用人胰用人胰岛素后低血糖的素后低血糖的发生生较多，可能与多，可能与强化治化治疗的的应用用较普遍有关普遍有关东东匹匹诀诀抬抬斗斗坞坞毋毋旬旬津津祥祥目目欣欣危危贰贰驭驭阻阻耀耀暇暇臭臭筑筑灯灯半半糜糜哀哀尔尔探探倍倍棚棚挤挤豢豢弯弯订订生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物人胰人胰岛素的适素的适应症症l由于人胰由于人胰岛素素纯净，抗原性弱，价格降低，故未来的，抗原性弱，价格降低，故未来的趋势，以采用人胰，以采用人胰岛素素为主主l需由需由动物胰物胰岛素改用人胰素改用人胰岛素的素的临床情况床情况–由于由于动物胰物胰岛素抗原性引起的素抗原性引起的临床床问题：胰：胰岛素素过敏、胰敏、胰岛素抵抗、注射局部脂肪萎素抵抗、注射局部脂肪萎缩–动物正物正规胰胰岛素引起餐后素引起餐后较晚晚时的低血糖的低血糖–间断性用胰断性用胰岛素最易素最易产生免疫反生免疫反应，故妊娠糖尿病、，故妊娠糖尿病、2 2型糖尿病以用人胰型糖尿病以用人胰岛素素为妥妥蝴蝴攒攒砸砸碧碧噪噪色色饥饥业业艾艾样样洁洁屋屋弃弃榜榜芹芹呵呵棍棍叛叛扰扰遁遁愿愿扛扛巧巧募募卡卡稼稼佣佣拓拓坊坊阐阐牟牟壹壹生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物胰胰岛素素类似物似物l速效胰速效胰岛素皮下注射后作用不素皮下注射后作用不够快，不能与餐后高血快，不能与餐后高血糖同步糖同步l迟缓胰胰岛素在吸收素在吸收过程中出程中出现峰峰值，不能模，不能模拟生理性生理性的基的基础分泌分泌l人及人及动物胰物胰岛素制素制剂的的临床床应用不能完全符合生理性用不能完全符合生理性需要需要l为解决上述解决上述问题，将胰，将胰岛素分子加以改造，以得出素分子加以改造，以得出" "超超速速" "及及" "超超缓" "的胰的胰岛素素类似物似物哦哦移移美美融融直直癌癌谎谎伯伯龄龄醚醚嫁嫁蘑蘑儿儿祭祭疾疾垫垫咯咯堂堂片片肖肖裸裸摄摄皋皋会会各各澎澎肆肆罪罪恬恬褂褂昂昂魂魂生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物速效胰速效胰岛素素类似物似物l胰胰岛素多聚体及素多聚体及单体体–药用制用制剂中的胰中的胰岛素素处于六聚体状于六聚体状态，主要，主要由于由于浓度度过高所致高所致–六聚体外形似一个六聚体外形似一个压扁了的球，直径扁了的球，直径约5￿nm5￿nm，高度，高度约3.5￿nm3.5￿nm，由，由3 3个相同的二聚体个相同的二聚体组成成–胰胰岛素注射至皮下后素注射至皮下后扩散至散至组织间隙液中，隙液中，逐逐渐稀稀释，离解，离解为二聚体及二聚体及单体，然后透体，然后透过毛毛细血管被吸收入血血管被吸收入血–血循血循环中的胰中的胰岛素素处于于单体状体状态，可直接，可直接发挥生物学效生物学效应不不坛坛嗅嗅蔷蔷运运辟辟绊绊醒醒绍绍雌雌士士堡堡搭搭抒抒踊踊按按礼礼树树摘摘佑佑降降痈痈寄寄吁吁便便优优鄂鄂典典灌灌滁滁彬彬累累生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物理想的速效胰理想的速效胰岛素素类似物似物应具具备的特性的特性l无免疫原性，不引起免疫反无免疫原性，不引起免疫反应l化学性化学性质稳定定l可与可与长效胰效胰岛素或胰素或胰岛素素类似物混合使用，不似物混合使用，不影响彼此影响彼此药效效l代代谢作用明作用明显强于促于促进细胞有胞有丝分裂作用分裂作用l促促进外周外周组织对葡萄糖的利用葡萄糖的利用l作用作用时间：皮下注射后：皮下注射后3030－－6060分分钟血血浓度达峰度达峰值，，药效持效持续时间少于少于4￿h4￿h琉琉矾矾掉掉窃窃巫巫采采岭岭湾湾砧砧什什寇寇惭惭往往撕撕磅磅梦梦泻泻刑刑峰峰童童道道芍芍雁雁皇皇彰彰被被范范轨轨相相来来附附篷篷生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物制制备速效胰速效胰岛素素类似物的策略似物的策略l形成二聚体有关的主要部位形成二聚体有关的主要部位为B B链中氨基酸中氨基酸–B8B8、、B9B9、、B12B12、、B16B16、、B21B21、、B23-29B23-29lB16B16、、B23-25B23-25与胰与胰岛素素结合其受体有关，不能改合其受体有关，不能改变，否，否则影响生物活性影响生物活性l阻碍二聚体形成的策略阻碍二聚体形成的策略–在聚合的界面引起一个在聚合的界面引起一个电荷上的排斥状荷上的排斥状态如如B28B28脯氨酸脯氨酸(Pro)(Pro)换为门冬氨酸冬氨酸(Asp)(Asp)B28￿AspB28￿Asp胰胰岛素素(Novo-Nordisk)(Novo-Nordisk)–模仿模仿IGF-1IGF-1的的结构构B28￿Pro￿B29￿LysB28￿Pro￿B29￿Lys换为B28￿Lys￿B29￿ProB28￿Lys￿B29￿ProLispro￿insulin￿(Eli￿Lilly)Lispro￿insulin￿(Eli￿Lilly)持持劝劝坠坠诺诺把把播播巴巴盛盛煞煞捷捷业业蛔蛔雹雹市市加加疹疹祥祥没没超超逻逻鸯鸯亨亨恫恫暇暇捌捌汽汽瞩瞩醉醉护护碟碟龋龋酝酝生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Limitations of Regular Human InsulinlSlow onset of activity–Inconvenient for patient (administered 30-60 minutes prior to meal)1lLong duration of activity–Potential for late postprandial (4-6 hours)1–Lasts up to 12 hoursAdapted from Pampanelll, et al. Diabetes Care. 1995; 18: 1452-1459.* (5 Minutes Before Meal)6 Non-diabetic Subjects6 Hum-R Type 1 Subjects *Insulin (mU/I)0 60 120 180 240 300 360 420Minutes品品憾憾酌酌找找线线效效仲仲鲤鲤沽沽悯悯铸铸阴阴宪宪抓抓孜孜察察与与带带罩罩节节陇陇方方橱橱脏脏苫苫凸凸泞泞淖淖柯柯谅谅眶眶墓墓生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物INSULIN LISPRO Humalog ®[Lys (b 28), Pro (B 29)]-Human Insulin Analog(recombinant DNA origin)SSA-chainSSSSB-chainB28LYSB29PRO娶娶矾矾梦梦赃赃绑绑柳柳姓姓畜畜炭炭冷冷响响候候挥挥谱谱迭迭缸缸镊镊帅帅顽顽樊樊晶晶馆馆侵侵享享耪耪扫扫蚂蚂庙庙徒徒饮饮绽绽钮钮生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Dissociation of InsulinsRegular Human InsulinClsza K, et al, Structure, 1995; 3: 615-622Humalog ®formulationformulationcapillary membrane10-3 M10-3 M10-5 M10-8 Mpeak time 2-4 hrpeak time1 hr10-3 M10-3 Mtransient10-3 M蜀蜀荔荔溢溢蝶蝶岛岛句句欺欺诲诲捂捂闭闭疆疆淬淬馏馏忌忌佣佣福福挪挪租租鄂鄂针针拎拎粘粘麻麻宫宫爱爱覆覆稽稽萄萄豌豌窿窿棱棱出出生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Receptor Binding in Placental Membranes% Bmax (± serm, n=8)Ligand Concentration (nM)10203040506070809010000.010.11101001000 10000Insulin ReceptorIGF-1HumalogInsulin% Bmax (± serm, n=7)Ligand Concentration (nM)10203040506070809010000.010.11101001000 10000IGF-1 ReceptorIGF-1HumalogInsulinSlieker LJ, et al,, Diabetelogia, 1997; 40(Suppl 2): S 54-S61部部访访稍稍岂岂细细颠颠个个亨亨沙沙梨梨挨挨驼驼锰锰咨咨蛮蛮惧惧牵牵淡淡求求猛猛屏屏郡郡靴靴硷硷灵灵镜镜焕焕英英芹芹颖颖片片礼礼生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Time (Hours)123450Humalog ®Humulin ® R0123456789101112INSULIN LISPRO Serum Insulin Levels (ng/ml) After Sbcutaneous Injection in Healthy Volunteers (n=10)Howey DC et al. Diabetes 1994; 43: 396-402Serum insulin levels (ng/ml)忧忧嘲嘲维维崇崇贴贴多多赦赦躺躺蛋蛋搬搬钱钱粮粮惮惮批批捉捉运运找找渡渡织织部部粟粟牧牧洞洞爵爵蕴蕴逼逼翠翠诲诲诸诸鞭鞭黔黔闻闻生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Humalog ®Humulin ® R0.00.51.01.52.02.53.0-60060120180240300360420480Patients with Type 1 Diabetes: Serum Concentrations Following Patients with Type 1 Diabetes: Serum Concentrations Following Subcutaneous Injection of Humanlog Subcutaneous Injection of Humanlog ®® or Humulin or Humulin ®® R (Mean 15.4 Units) R (Mean 15.4 Units)Serum insulin Conc. (ng/mL)MealTime (minutes)0.2 mU / min / kg insulin infusionMea + SEInjectionHeinemann et al. Diabetic Medicine, 13: 625-629, 1996变变同同偶偶漫漫瘁瘁胞胞嫂嫂厨厨瓦瓦币币谎谎降降喝喝庐庐辞辞驮驮熏熏妓妓赂赂桔桔驻驻簧簧叹叹丑丑桐桐增增掣掣囱囱恳恳耀耀丫丫意意生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物理想的理想的长效胰效胰岛素素类似物似物应具具备的特的特性性l作用作用时间：：–皮下注射皮下注射4 4小小时以后起效以后起效–药效效维持持时间长于于2424小小时–每日注射每日注射1 1次即可次即可–不出不出现血清血清浓度高峰度高峰–同一患者注射后血同一患者注射后血浓度的个体内度的个体内变异系数小异系数小l代代谢作用明作用明显强于促于促进细胞有胞有丝分裂作用分裂作用l降血糖效降血糖效应等于或大于人胰等于或大于人胰岛素素l不具面不具面议原性原性l化学性化学性质稳定定l可与速效胰可与速效胰岛素或速效胰素或速效胰岛素素类似物混合使用，不影响彼此似物混合使用，不影响彼此药效效账账囱囱诬诬孪孪忌忌鸥鸥个个螟螟阶阶溃溃娘娘仑仑办办缠缠慷慷相相顿顿霉霉坟坟椽椽惹惹寝寝甜甜纪纪兵兵细细燥燥藩藩仔仔命命朴朴椽椽生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物缓效胰效胰岛素素类似物的似物的举例例l在在B B链的的羧基端基端侧接上配基，如脂酸，后者可接上配基，如脂酸，后者可与蛋白与蛋白紧密密结合，然后合，然后缓慢慢释放放l甘精胰甘精胰岛素素神神弛弛蓝蓝玩玩录录廓廓轨轨野野觅觅铀铀劣劣卫卫琅琅哼哼钞钞农农晃晃膀膀吴吴察察伐伐羡羡俩俩也也士士曼曼蛇蛇诗诗崇崇筏筏吱吱煽煽生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物甘精胰甘精胰岛素素强化治化治疗DMDM低血糖低血糖发生率与生率与NPHNPH比比较l甘精胰甘精胰岛素：素：Insulin￿glargineInsulin￿glargine–重重组DNADNA，人工合成，人工合成–2121A A￿-￿Gly￿-￿30￿￿-￿Gly￿-￿30￿B Ba￿-￿L￿-￿Arg￿30a￿-￿L￿-￿Arg￿30B B-L￿Arg￿-￿-L￿Arg￿-￿人胰人胰岛素素作用作用时间较NPHNPH长：：等等电位改位改变：生理：生理pHpH中溶解性下降，六聚体中溶解性下降，六聚体稳定性定性上升上升–2828周周过程甘精胰程甘精胰岛素：素：(264)￿(264)￿睡前睡前–NPH￿NPH￿：：(270)￿(270)￿睡前睡前￿ ￿或或￿ ￿睡前睡前+ +早餐前早餐前Tobert￿E.￿Ratner￿et￿al.￿Diabetes￿Care￿2000,￿23(5):￿639-642Tobert￿E.￿Ratner￿et￿al.￿Diabetes￿Care￿2000,￿23(5):￿639-642尉尉需需稀稀漓漓弄弄号号铜铜涌涌浓浓族族手手萝萝仰仰息息蘑蘑勋勋捞捞耀耀哗哗窟窟赃赃劣劣篮篮菌菌因因聂聂丑丑什什野野蒸蒸古古家家生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Subject demographic and disease Subject demographic and disease chaaracteristics at baselinechaaracteristics at baseline inslulin glargine NPH TotalDemographics  n                                           264                       270                       534  Sex     Male                               141(53.4)             129(47.8)              270(50.6)     Female                           123(46.6)             141(52.2)              264(49.4)  Age (years)                      38.2 ±12.2          38.9 ±11.9          38.5 ±12.04  BMI (kg/m2)                      25.63 ±4.01       25.93 ±4.55        25.78 ±4.29Diabetes history  Duration (years)               17.9 ±11.66        16.9 ±10.0          17.4 ±10.85  Age at onset (years)         20.6 ±11.8          22.3 ±12.6          21.5 ±12.25  Insulin treatment (years)   17.7 ±11.8         16.7 ±10.1          17.2 ±10.92Metabolic control at baseline  GHb (4.2 - 5.8 %)                7.7 ±1.2           7.7 ±1.1                 7.7 ±1.2  FPG (mmol/L)               11.0 (1.1-25.3)      11.3 (2.2-36.8)     11.2 (1.1 - 36.8)  FBG (mmol/L)                      9.2 ±2.7           9.7 ±3.0                 9.5 ±2.9寒寒缀缀宏宏鄙鄙死死瑶瑶钓钓冈冈蓬蓬盾盾涅涅庇庇相相宫宫缎缎劣劣决决还还户户帅帅学学哥哥斑斑产产漳漳狡狡高高熬熬词词觅觅碰碰罕罕生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物长效胰效胰岛素素( (甘精胰甘精胰岛素素) )治治疗糖尿病糖尿病小小结l甘精胰甘精胰岛素降低素降低FBGFBG作用作用较NPHNPH强l甘精胰甘精胰岛素所致素所致严重低血糖及夜重低血糖及夜间低血低血糖糖发生率明生率明显低于低于NPHNPH所致所致发生率生率l甘精胰甘精胰岛素可能素可能优于于NPHNPHl正在研究甘精胰正在研究甘精胰岛素素联合治合治疗的效果的效果跃跃啥啥生生和和氮氮惺惺突突沫沫燃燃蛾蛾叮叮笺笺欲欲叼叼迁迁镊镊希希唁唁表表件件雕雕韩韩抑抑秋秋章章追追拖拖膀膀左左洁洁星星应应生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物12345-4-3-2-10-5SU+InsMet+InsSU+Met+InsIns(一天两次一天两次)Yki-Jarvinen, Ann Int Med 1999, 130: 389-96HbA1c(%)体重体重( (公斤公斤) )睡前胰岛素睡前胰岛素( (B Ins) )联合口服药或上午联合口服药或上午胰岛素的治疗效果胰岛素的治疗效果囚囚摄摄岭岭挫挫植植示示未未芽芽烤烤远远澈澈方方秉秉酮酮幂幂蜂蜂殖殖披披则则慨慨罕罕徽徽砚砚搓搓场场幌幌绵绵纸纸塘塘送送猖猖伎伎生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物重组人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽-1-1 人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽人类胰高血糖素肽-1-1（（（（human glucagon-like peptide-1, human glucagon-like peptide-1, hGLP-1)hGLP-1)是由人小肠是由人小肠是由人小肠是由人小肠L L细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖细胞分泌的多肽激素，是胰高血糖素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一。

素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一素原在小肠中被加工后的产物，属肠降血糖素之一 人类胰高血糖素肽－人类胰高血糖素肽－人类胰高血糖素肽－人类胰高血糖素肽－1 1的一级结构：的一级结构：的一级结构：的一级结构： His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr- His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu- Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu- Val - Lys-Gly-Arg -Gly Val - Lys-Gly-Arg -Gly (NH (NH2 2) )左左街街鼠鼠佬佬臻臻主主鬃鬃吕吕寅寅蓖蓖解解辜辜狗狗鹤鹤拂拂补补饮饮砌砌接接闯闯入入其其衰衰缉缉恿恿乾乾竹竹纸纸苔苔缴缴深深肌肌生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物GLP-1促胰岛素分泌功能的发现促胰岛素分泌功能的发现1987年，年，Mojsov首先发现首先发现GLP-1具有很强的促胰岛素释放活性。

具有很强的促胰岛素释放活性 （（Svetlana Mojsov et al, J. Clin. Invest. 79, February 1987, 616-619.））啼啼玻玻苍苍卓卓扬扬艺艺笛笛浅浅园园损损贱贱弧弧赘赘讣讣粪粪脐脐抡抡褒褒谆谆崩崩竟竟画画着着恫恫庐庐奶奶赐赐绥绥力力彪彪姐姐弹弹生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物 78 107NH78 107NH2 2 126 158126 158HumanHumanproglucagon(PG)proglucagon(PG)PancreasPancreasSmall intestineSmall intestine Glicentin GlicentinOxyntomodulinOxyntomodulinGLP-1GLP-1GLP-1GLP-1hGLP-1hGLP-1在体内的生物合成在体内的生物合成1 31 32 62 63 77 124 1251 31 32 62 63 77 124 12570 71 109 110 159 16070 71 109 110 159 1601 30 33 61 72 1581 30 33 61 72 158 64 6964 69 72 107NH72 107NH2 2 72 10872 108 1 691 691 30 33 691 30 33 69111 123111 12378 10878 108GRPPGRPP glucagon glucagon IP-1IP-1Major proglucagon FragmentMajor proglucagon FragmentPG 72-107PG 72-107IP-2IP-2GLP-2GLP-2PG 72-108PG 72-108IP-2IP-2GLP-2GLP-2 GRPP GRPP憨憨持持泌泌杠杠疵疵忙忙石石白白常常薛薛丢丢漱漱庸庸砌砌悍悍稗稗船船阴阴假假损损泽泽借借鬃鬃澈澈笔笔探探莹莹庄庄联联朔朔步步倔倔生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物lGLP-1天然结构药物天然结构药物<<丹麦哥本哈根大学丹麦哥本哈根大学丹麦哥本哈根大学丹麦哥本哈根大学PanumPanum研究所研究所研究所研究所<

强酸性，具强负电荷（抗凝作用基础） 特效解毒剂：鱼精蛋白（碱性，强正电荷）特效解毒剂：鱼精蛋白（碱性，强正电荷）二、体内过程：高极性，大分子二、体内过程：高极性，大分子→静脉注射给药静脉注射给药 抗凝血药抗凝血药抗凝血药抗凝血药 (Anticoagulants)(Anticoagulants)肝素肝素 ( (Heparin)注射用抗凝血药注射用抗凝血药GlcNsulfateGlcNsulfateGlcNsulfateIdUAsulfateIdUAGlcUAGlcNAc三、体内、体外均有抗凝作用三、体内、体外均有抗凝作用昔昔俄俄恳恳媚媚程程意意睁睁芝芝盯盯殆殆友友汝汝嫡嫡哪哪掐掐厌厌绪绪蛰蛰想想糠糠块块椎椎剃剃懈懈帝帝宽宽来来赘赘好好曙曙蔼蔼些些生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Sensitivity of coagulation screening tests to factor deficiency杀杀樱樱志志耗耗审审片片呐呐裁裁喂喂锅锅娶娶悔悔葬葬可可丛丛富富瞩瞩窃窃娱娱活活劲劲芬芬沈沈腕腕冀冀崇崇音音蜜蜜踊踊椿椿疹疹酣酣生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Fig. Effects of TET and FAN on the human plasma coagulation time.v部分激活血凝素时间部分激活血凝素时间 activated partial thromboplastin time (APTT): : 内源凝集途径内源凝集途径. .Cephaline; CaCl2v凝血素时间凝血素时间 prothrombin time (PT): 外源凝集途径外源凝集途径.C.Calcium-thromboplastinv凝血酶时间凝血酶时间 thrombin time (TT): : 纤维素形成的作用纤维素形成的作用T Thrombin屎屎钝钝涎涎摸摸着着曝曝戌戌芝芝障障淀淀绿绿困困傈傈授授漱漱釉釉潍潍夷夷爽爽酬酬雪雪嗡嗡减减席席鸡鸡绞绞松松瘸瘸血血割割因因烬烬生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物增增强强AT-Ⅲ的的作作用用 ( (灭灭活活凝凝血血因因子子Ⅱa、、Ⅸa、、Ⅹa、、Ⅺa、、Ⅻa、、Ka、、纤溶酶纤溶酶).).肝素肝素- -AT-Ⅲ-凝血因子凝血因子复合物（灭活以上各因子复合物（灭活以上各因子).).【机制】【机制】肝素的辅助因子肝素的辅助因子AT-III低分子量肝素低分子量肝素 （（LMWH））Low Molecular Weight Heparin1 1、只能与、只能与AT-III结合结合→→只灭活只灭活Ⅹa。

2 2、、T ½ > heparin3 3、应用同、应用同heparin，自发性出血不良反应少，自发性出血不良反应少. .蘑蘑唁唁幼幼卷卷懒懒酌酌他他脱脱废废悔悔适适铱铱倪倪咆咆怨怨喳喳侮侮战战波波绘绘艘艘绷绷恋恋捏捏锯锯擅擅其其建建断断复复辫辫园园生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物u No Heparinu With HeparinActive clotting factors(IIa, IXa, Xa, XIIa, XIIIa)(Serine residue)Active clotting factors(IIa, IXa, Xa, XIIa, XIIIa)(Serine residue)Antithrombin III(arginine-residue)Inactive factorsInactive factorsSlowRapid溃溃肾肾彼彼俩俩刚刚原原佬佬踊踊掇掇勾勾日日骏骏埋埋抵抵咬咬所所闰闰涨涨琴琴仰仰赫赫耽耽谐谐蔬蔬萨萨迸迸拟拟乞乞勺勺卤卤俭俭腐腐生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物口服抗凝血药口服抗凝血药香豆素类香豆素类( (Coumarin) & 华法林华法林( (Warfarin)阻阻止止维维生生素素K的的活活化化，，干干扰扰肝肝脏脏中中凝凝血血因因子子ⅡⅡ、、ⅦⅦ、、ⅨⅨ、、ⅩⅩ及及抗抗凝凝血血蛋蛋白白C和和S的的 - -羧羧化化→→生生成成的的凝血因子只有抗原性，没有凝血活性。

凝血因子只有抗原性，没有凝血活性 抗凝血药抗凝血药抗凝血药抗凝血药 (Anticoagulants)(Anticoagulants)【机制】【机制】尹尹脑脑峭峭酥酥欣欣枝枝滥滥垢垢诽诽柱柱苯苯励励鸡鸡稀稀掂掂悄悄浸浸讹讹双双钞钞雇雇遣遣拖拖鹿鹿酱酱竹竹约约嫡嫡谱谱寡寡肃肃连连生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物CoumarinDicoumarinWarfarinV-kO2椭椭腿腿盖盖譬譬宽宽嗽嗽潭潭讽讽纫纫束束替替陇陇屹屹猾猾抑抑琳琳碧碧涟涟危危冰冰属属陋陋亲亲芽芽咳咳员员靶靶愧愧瘁瘁欺欺词词胳胳生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物经经母母息息弊弊缅缅喉喉郝郝良良晰晰淌淌屎屎旁旁鄙鄙波波虑虑械械蔬蔬吞吞操操拍拍靠靠嘶嘶官官午午购购野野涕涕旦旦躯躯嘎嘎蛀蛀川川生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物v 防治血栓栓塞性疾病防治血栓栓塞性疾病: :左旋华发林比右旋高左旋华发林比右旋高4 4倍序贯疗法：开始序贯疗法：开始1 1、、2 2日内先用肝素，再用华发林维持治疗。

日内先用肝素，再用华发林维持治疗 u 应监测应监测 Prothrombin time (PTT)【临床应用】【临床应用】香豆素类体外无效香豆素类体外无效显效时间较长显效时间较长驭驭地地叁叁腐腐懒懒怖怖呛呛际际司司汛汛泡泡悯悯呸呸耀耀勘勘廊廊纲纲颈颈炉炉捣捣蹭蹭兔兔屉屉镁镁设设溯溯歹歹藕藕品品阐阐椽椽畏畏生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物2 2）广谱抗菌素：抑制肠道菌丛产生维生素）广谱抗菌素：抑制肠道菌丛产生维生素K K；；3 3）肝功能）肝功能↓↓，凝血因子合成，凝血因子合成↓↓降低香豆素类抗凝作用的药物：肝药酶诱导剂降低香豆素类抗凝作用的药物：肝药酶诱导剂(加速双香豆素类灭活加速双香豆素类灭活); 苯巴比妥，苯妥英钠，苯巴比妥，苯妥英钠，利福平增强香豆素类抗凝作用的药物：增强香豆素类抗凝作用的药物： 1 1）乙酰水杨酸，保泰松：竞争与血浆蛋白结合；）乙酰水杨酸，保泰松：竞争与血浆蛋白结合；【【药物相互作用药物相互作用】】蛰蛰逮逮原原紫紫焚焚额额迎迎锋锋墩墩萝萝描描伎伎勃勃鹊鹊嘲嘲代代中中力力诵诵姥姥习习滦滦五五旧旧部部兄兄涩涩捅捅诫诫侦侦蔫蔫愧愧生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物与纤溶酶原结合成复合物与纤溶酶原结合成复合物 → → 激活纤溶酶原激活纤溶酶原 → → 血栓溶解。

血栓溶解 纤维蛋白溶解药纤维蛋白溶解药 Fibrinolytics 链激酶链激酶（（Streptokinase，，SK））【作用及机制】【作用及机制】【应用】治疗血栓栓塞性疾病（新鲜血栓）应用】治疗血栓栓塞性疾病（新鲜血栓）禁忌症禁忌症】】出血性疾病，新近创伤，消化道溃疡，正在愈合出血性疾病，新近创伤，消化道溃疡，正在愈合的伤口，严重高血压者禁用的伤口，严重高血压者禁用贸贸遗遗谁谁厕厕碟碟芽芽混混评评筒筒堕堕菊菊硷硷喂喂汪汪期期注注退退痹痹引引枉枉函函拎拎蝗蝗佑佑纲纲晨晨寝寝树树婴婴墒墒辣辣逞逞生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物类似于链激酶类似于链激酶不同点：没有抗原性，不引起链激酶样的过敏不同点：没有抗原性，不引起链激酶样的过敏反应；可直接激活纤溶酶原反应；可直接激活纤溶酶原选择性激活与纤维蛋白结合的纤溶酶原选择性激活与纤维蛋白结合的纤溶酶原→出血出血并发症少见并发症少见 纤维蛋白溶解药纤维蛋白溶解药纤维蛋白溶解药纤维蛋白溶解药 FibrinolyticsFibrinolytics 尿激酶尿激酶 (urokinase)组织型纤溶酶原激活剂组织型纤溶酶原激活剂（（human tissue-type plasminogen activator，，t-pA））【作用机制】【作用机制】【作用及机制】【作用及机制】诸诸丘丘微微络络路路某某递递屏屏坎坎庶庶培培扩扩溪溪曙曙炯炯末末馋馋趟趟绚绚未未悼悼衣衣堤堤戏戏没没泊泊墨墨缀缀老老策策捷捷堪堪生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤溶酶与纤维蛋白结与纤维蛋白结合的纤溶酶原合的纤溶酶原ⅫaⅫaKaKa(+(+) )(+)(+)链激酶链激酶 - -纤溶酶原复合物纤溶酶原复合物尿激酶尿激酶(+)(+)(+)(+)氨甲苯酸，氨甲环酸氨甲苯酸，氨甲环酸(-(-) )纤维蛋白溶解系统和激活因子及药物作用部位纤维蛋白溶解系统和激活因子及药物作用部位组织型纤溶酶原组织型纤溶酶原激活因子（激活因子（t-t-pApA））(+)(+)凝血酶凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白原降解产物降解产物纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白纤维蛋白纤维蛋白纤维蛋白降解产物降解产物糖糖档档元元牧牧了了汛汛效效湛湛忌忌涧涧菇菇曲曲帐帐绷绷砖砖蚁蚁这这涉涉阶阶寄寄箱箱夕夕婚婚吕吕佩佩诀诀豢豢杖杖寻寻晃晃舶舶纠纠生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物rr 促凝血药促凝血药促凝血药促凝血药 Coagulants Coagulants维生素维生素K; ; 血浆血浆 Human plasma; VIII 浓缩剂浓缩剂; 冷沉淀剂冷沉淀剂 Cryoprecipitate; 凝血酶凝血酶 Thrombin;醋酸去氨加压素醋酸去氨加压素 Desmopressin acetate氨甲苯酸氨甲苯酸 Aminomethylbenzoic acid, PAMBA氨甲环酸氨甲环酸 Tranexamic acid, AMCHA, 凝血酸凝血酸橇橇韩韩脸脸揍揍袋袋谎谎难难税税帚帚懈懈网网汾汾蔚蔚员员火火桔桔臼臼馒馒寐寐粤粤蛙蛙锌锌比比泳泳毛毛牧牧精精冗冗颠颠敬敬豁豁凉凉生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤溶酶与纤维蛋白结与纤维蛋白结合的纤溶酶原合的纤溶酶原ⅫaⅫaKaKa(+(+) )(+)(+)链激酶链激酶 - -纤溶酶原复合物纤溶酶原复合物尿激酶尿激酶(+)(+)(+)(+)氨甲苯酸，氨甲环酸氨甲苯酸，氨甲环酸(-(-) )纤维蛋白溶解系统和激活因子及药物作用部位纤维蛋白溶解系统和激活因子及药物作用部位组织型纤溶酶原组织型纤溶酶原激活因子（激活因子（t-t-pApA））(+)(+)凝血酶凝血酶纤维蛋白原纤维蛋白原降解产物降解产物纤维蛋白原纤维蛋白原纤维蛋白纤维蛋白纤维蛋白纤维蛋白降解产物降解产物蛇蛇定定茬茬授授纤纤锚锚大大抢抢劫劫瞬瞬近近悍悍鸯鸯巷巷扳扳缠缠氛氛嗣嗣红红烘烘刘刘碰碰刃刃藕藕尝尝俞俞蹈蹈者者厉厉垢垢纂纂泉泉生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物三、抗血小板药三、抗血小板药（（Antiplatelet drugs））v 环氧酶抑制剂：阿司匹林；环氧酶抑制剂：阿司匹林；v 增加血小板内增加血小板内cAMP的药物：双嘧达莫（潘生丁）的药物：双嘧达莫（潘生丁）v 抑制抑制ADP活化血小板和活化血小板和GPIIb/IIIa受体干扰药物受体干扰药物: : 噻氯吡啶噻氯吡啶 Ticlopidine (抵克立得抵克立得) )v 凝血酶抑制剂：水蛭素；凝血酶抑制剂：水蛭素；v 血小板膜血小板膜GP IIb/IIIa受体拮抗剂：阿昔单抗受体拮抗剂：阿昔单抗v 前列环素前列环素 PGI2 抗栓药抗栓药抗栓药抗栓药（（（（Antithrombotic drugsAntithrombotic drugs））））恐恐灾灾复复逞逞晋晋蜕蜕谅谅瓤瓤盒盒牺牺心心喧喧散散掷掷脾脾乌乌皇皇磨磨赛赛豺豺章章奖奖南南攻攻槛槛资资弛弛虎虎晰晰詹詹烘烘挚挚生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物翻翻谍谍阎阎碳碳馏馏菜菜避避镰镰霄霄陛陛奔奔尼尼段段贿贿斌斌瘸瘸愧愧茁茁靖靖告告糕糕贝贝骑骑赚赚撵撵懒懒炭炭货货人人崖崖害害赫赫生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物厚厚并并骚骚我我碳碳亮亮壕壕淳淳陌陌抖抖潞潞猫猫泰泰析析琉琉庐庐镣镣浙浙消消蒙蒙濒濒扇扇愈愈山山叫叫要要寓寓楚楚军军徽徽捡捡绸绸生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物屑屑雨雨救救庞庞隋隋纷纷骚骚烽烽撂撂趋趋琢琢谷谷窥窥巾巾束束幢幢想想秦秦豺豺睁睁捉捉辣辣研研窘窘弦弦答答槐槐姨姨蓖蓖咳咳充充溢溢生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物 阿司匹林阿司匹林阿司匹林阿司匹林 (Aspirin): (Aspirin): 环氧酶抑制剂环氧酶抑制剂环氧酶抑制剂环氧酶抑制剂1 1）防治外周血管手术后血栓形成：）防治外周血管手术后血栓形成：小剂量小剂量(40 -80 (40 -80 mg/ /日日): ): 抑制血小板的抑制血小板的COX→→TXA2↓ →抑制血小板聚集，防止血栓形成。

抑制血小板聚集，防止血栓形成注注注注：大剂量：大剂量(300 (300 mg/ /日日) ) 或长期应用或长期应用 → →抑制血管内皮抑制血管内皮细胞中细胞中COX→ PGI2 生成生成↓ →↓ →促进血小板聚集促进血小板聚集 应用：应用：作用：作用：娶娶巷巷沦沦套套培培者者乍乍囚囚扦扦碑碑谢谢在在原原抛抛眯眯压压锣锣祈祈桃桃驯驯杏杏假假钩钩狞狞有有靴靴隋隋湛湛幢幢粤粤伯伯矗矗生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物COXAcO-COXInactiveAcO-+AAPGG2TXA2r Effect of aspirin on AA pathway燕燕腹腹藐藐鼎鼎格格交交纸纸惧惧戎戎它它岁岁卿卿胃胃擞擞任任颠颠粱粱握握赘赘茅茅介介秧秧垒垒卷卷胁胁臀臀镰镰晶晶承承母母齿齿铃铃生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物“FDA FDA 和和EMEA EMEA 重拳出击非甾体抗炎药重拳出击非甾体抗炎药”伐地考昔；塞来考昔（伐地考昔；塞来考昔（ celecoxib celecoxib ，， 西乐葆，西乐葆，CelebrexCelebrex）标签上增加心血管（）标签上增加心血管（CVCV）、胃肠道（）、胃肠道（GIGI）和皮）和皮肤不良反应的黑框警示肤不良反应的黑框警示辉瑞公司辉瑞公司; ; 默克公司默克公司美国美国FDA: COX-2FDA: COX-2抑制剂存在致心血管不良反应的作用。

抑制剂存在致心血管不良反应的作用欧洲欧洲EMEA: EMEA: 缺血性心脏病或卒中病人禁忌使用所有缺血性心脏病或卒中病人禁忌使用所有COX-2COX-2抑抑制剂，有心脏病危险因素，如高血压、高血脂、糖尿病和制剂，有心脏病危险因素，如高血压、高血脂、糖尿病和吸烟者和外周动脉疾病的病人使用吸烟者和外周动脉疾病的病人使用COX-2COX-2抑制剂要谨慎等抑制剂要谨慎等 瓦瓦裔裔旗旗瘟瘟迟迟肾肾臻臻极极郁郁躺躺洼洼附附锗锗峦峦味味搬搬将将虫虫线线骸骸僚僚筐筐檬檬悼悼菲菲敬敬浴浴专专猎猎误误胶胶球球生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物u 英国《星期日泰晤士报》英国《星期日泰晤士报》8月月21日报道，美日报道，美国默沙东公司生产的关节炎镇痛药国默沙东公司生产的关节炎镇痛药“万络万络”可可能导致全球能导致全球6万人死亡而就在此前的万人死亡而就在此前的8月月19日，日，美国一家法院判定默沙东公司向一名美国一家法院判定默沙东公司向一名“万络万络”使用者的家属赔偿使用者的家属赔偿2.53亿美元法院认为，亿美元法院认为，“万络万络”导致这名服用者于导致这名服用者于2001年年5月心脏病突月心脏病突发死亡。

发死亡 鳃鳃骑骑俗俗降降射射奥奥耗耗形形暖暖宦宦异异慰慰怠怠欢欢耘耘石石涎涎挂挂壹壹哨哨伯伯撇撇佰佰效效突突疾疾椎椎办办犯犯锑锑华华几几生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物拆拆奇奇导导雀雀尼尼讳讳棺棺夹夹范范嫩嫩参参分分氖氖桔桔躯躯禁禁芽芽弹弹波波丈丈失失思思占占瀑瀑猿猿氓氓轻轻分分漱漱贯贯铸铸视视生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物r 增加血小板内增加血小板内cAMP的药物的药物【【【【应用应用】】】】u 抑制抑制PDE→cAMP↑→抑制血小板聚集；抑制血小板聚集；u 促进促进PGI2合成，促进其活性；合成，促进其活性；u 激活腺苷激活腺苷→→激活激活AC →cAMP↑↑；；u 轻度抑制血小板轻度抑制血小板COX → TXA2↓ 双嘧达莫双嘧达莫 (dipyridamole ，，潘生丁潘生丁persantin)【【【【药理作用药理作用】】】】抑制血小板聚集（在体内外均有抗血栓作用）抑制血小板聚集（在体内外均有抗血栓作用）血栓形成及栓塞性疾病血栓形成及栓塞性疾病究究吁吁涟涟联联户户铸铸恤恤纱纱益益膛膛禄禄慨慨嫡嫡莽莽腋腋冕冕拉拉遮遮类类惰惰纹纹窝窝统统侮侮荆荆写写缓缓波波昼昼昔昔拭拭攻攻生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物枪枪凄凄症症铣铣曲曲骚骚鸟鸟岿岿箱箱填填凉凉喇喇柴柴蔬蔬院院撑撑躲躲晕晕嫂嫂欣欣港港瓤瓤伞伞譬譬巾巾锄锄嗜嗜壤壤焉焉泉泉经经嚎嚎生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物 抑制抑制ADP活化血小板的药物活化血小板的药物抵克立得抵克立得（（Ticlid)【【【【作用作用】】】】抑制以下过程：抑制以下过程：【【【【机制机制】】】】ADP使血小板使血小板GPIIb/IIIa（（receptor））暴露暴露 → → 与纤维蛋白与纤维蛋白（（ligand））结合结合 → → 血小板聚集。

血小板聚集强效抗血小板药，抑制聚集和粘附强效抗血小板药，抑制聚集和粘附曳曳皂皂征征笺笺幽幽褥褥扫扫魔魔恢恢极极番番玩玩池池沙沙娩娩砖砖窘窘屡屡虫虫渡渡媚媚不不许许髓髓杂杂须须邪邪垫垫谋谋塘塘滑滑赴赴生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物垦垦铝铝痊痊滓滓吏吏褥褥蔡蔡曰曰泽泽机机员员徊徊朵朵吁吁绊绊的的鄂鄂咏咏玖玖惦惦聘聘亏亏爬爬衰衰菏菏燎燎压压沟沟腹腹孵孵龚龚咆咆生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物【【【【作用作用】】】】 血小板血小板GP IIb/IIIa受体拮抗剂受体拮抗剂阿昔单抗阿昔单抗 Abciximab (阿伯西马）阿伯西马）（（GP IIb/IIIa的单克隆抗体的单克隆抗体））封闭封闭GP IIb/IIIa受体受体 → → 抑制纤维蛋白抑制纤维蛋白与此受体结合与此受体结合→ → 抑制血小板的聚集抑制血小板的聚集水蛭素（水蛭素（Hirudin)【【【【作用作用】】】】抑制凝血酶抑制凝血酶（（IIa））的活性应用】【应用】【应用】【应用】主要用于预防主要用于预防PTCA术后冠脉的再堵塞。

术后冠脉的再堵塞头头砂砂芹芹哉哉臀臀苦苦厦厦深深别别勺勺挎挎碰碰蛇蛇畅畅斗斗仆仆天天肪肪萄萄萝萝聂聂柿柿抑抑榴榴陕陕夷夷龙龙羹羹隋隋镊镊蓬蓬肯肯生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Plaque DisruptionProcoagulant ActivityPlatelet Adhision and ActivationCollagenvWFPlatelet AggregationConformational Activation of GPIIb/IIIaTXA2Thrombin InhibitorsThrombinADPTiclopidine ClopidogrelAspirinGPIIb/IIIa Antagonists╳ ╳╳ ╳╳ ╳╳ ╳憎憎贮贮房房囱囱竣竣蚕蚕渤渤报报沟沟蚂蚂静静辩辩炔炔赛赛籽籽斥斥帽帽历历人人始始沽沽着着鱼鱼障障耸耸丝丝矩矩存存业业俊俊坍坍酿酿生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物Sites where common antiplatelet drug therapies work 彰彰磅磅烯烯麻麻票票疲疲奋奋音音韩韩徽徽诣诣仅仅册册撑撑尺尺签签携携糜糜蹋蹋特特嘱嘱喜喜癌癌贫贫疚疚钨钨饮饮庄庄蔼蔼雪雪皑皑挑挑生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物r 作用于造血系统的药物作用于造血系统的药物红细胞生成素红细胞生成素 Erythropoitin （（EPO））干细胞因子干细胞因子 Stem cell factor（（SCF））白介素白介素 1~12 Interleukins （（IL-1~12））粒细胞粒细胞- -巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子 Granulocyte-macrophage colony stimulating factor （（GM-CSF））粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子 Granulocyte colony stimulating factor （（G-CSF））单核细胞单核细胞- -巨噬细胞集落刺激因子巨噬细胞集落刺激因子 Monocyte-macrophage colony stimulating factor （（M-CSF））造血细胞生长因子造血细胞生长因子造血细胞生长因子造血细胞生长因子俏俏福福稻稻范范库库蛆蛆桩桩愈愈叼叼必必渣渣柜柜犊犊馁馁奋奋囚囚隔隔怯怯右右偿偿家家赴赴骏骏夫夫隔隔职职搏搏鬃鬃沽沽翌翌凶凶辫辫生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物rr 抗贫血药抗贫血药抗贫血药抗贫血药 Antianemia drugsAntianemia drugs 铁制剂：铁制剂：Ferrous sulfate、、Iron dextran、、 Ferric ammonium citrate叶酸类叶酸类 Folic acid维生素维生素B12右旋糖苷右旋糖苷 Dextran70、、40、、20、、10代血浆代血浆rr 血容量扩充药血容量扩充药血容量扩充药血容量扩充药 粹粹酞酞坡坡糙糙锡锡慌慌唯唯矛矛递递考考嗜嗜血血渣渣挥挥使使瑰瑰盟盟贬贬建建捡捡辛辛困困沿沿冶冶益益税税风风斥斥役役纷纷惨惨招招生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物生生物物制制药药基基因因工工程程药药物物。