Kaposi肉瘤组织中长链非编码RNA的表达.docx

Kaposi肉瘤组织中长链非编码RNA的表达Kaposi肉瘤是一种罕见的低度恶性的血管肉瘤,病因和发病机制尚未完全明确[1]近年来,随着高通量测序技术的发展,非编码RNA被发现在肿瘤的发病机制中起到一定作用,并成为目前研究的热点,miRNA已经证实与Kaposi肉瘤发生发展有关[2,3,4]lncRNA占非编码RNA80%以上,可能有比miRNA更复杂的作用,许多研究提示其可能成为肿瘤治疗新的靶点[5,6]本研究通过应用高通量lncRNA芯片技术筛选出Kaposi肉瘤组织与瘤旁正常组织差异表达的lncRNA,聚类(GO)分析筛选出与Kaposi肉瘤相关的lncRNA,为进一步阐明Kaposi肉瘤的发病机制提供实验依据1、资料与方法1.1一般资料收集2016年3～7月新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科经临床和病理确诊的5例Kaposi肉瘤患者瘤体和瘤旁正常皮肤组织,所有标本一经离体立即投入冻存管中,于液氮中保存所有患者于取材前3个月未系统使用过免疫调节剂、糖皮质激素等治疗,且停止紫外线光疗及外用药物治疗至少1个月;所有标本均经过2位高年资皮肤病理专家阅片证实本研究获新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准,所有患者均填写卡波西肉瘤流行病调查表,并签署知情同意书。

5例Kaposi肉瘤患者中,男3例,女2例;年龄平均(57±20.34)岁;均为维吾尔族;均为经典型Kaposi肉瘤1.2实验材料样本组织总RNA的提取试剂RNAisoPlus(TAKARA),质检Bioanalyzer2100,RNA纯化试剂盒RNeasyminikit(QIAGEN),cRNA合成和标记试剂盒(Agilenttechnologies),SYBRGreenI(Takara),紫外分光光度计ND-2000(NanoDrop),ABI7500荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems),lncRNA芯片杂交盒(Agilenttechnologie),芯片扫描仪(Agilenttechnologies)lncRNA芯片为上海伯豪公司的4×180khumanceRNA表达芯片1.3实验方法1.3.1组织总RNA的抽提和纯化取液氮冻存的Kaposi肉瘤和瘤旁正常组织,采用TAKARARNAisoPlus并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的totalRNA抽提,抽提所得totalRNA质检合格后使用RNeasyminikit和RNase-FreeDNaseSet进行总RNA的纯化。

NanoDropND-2000紫外分光光度仪检测样本总RNA,样本OD260/280均在1.7～2.1,说明RNA纯度高,28S/18S≥0.7/OD为合格,满足芯片实验要求,见表1表1测序样本总RNA质检结果1.3.2芯片杂交、扫描及数据读取分析实验样品RNA采用LowInputQuickAmpWTLabelingKit和标准操作流程对样品总RNA进行放大和标记,并用RNeasyminikit纯化标记后的cRNA按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒GeneExpressionHybridizationKit组装好杂交仓,将标记后的样本置于滚动杂交炉中65℃,10rpm,滚动杂交17h,杂交cRNA上样量1.65μg,并在洗缸中洗片,洗片所用的试剂为GeneExpressionWashBufferKit杂交后的芯片采用AgilentMicroarrayScanner进行扫描用FeatureExtractionsoftware10.7读取数据,最后采用R软件中limma包进行归一化处理,分别绘制散点图、火山图和热图,并进行GO分析和KEGGpathway分析1.3.3qRT-PCR用研磨仪将组织样本研磨均匀,以Takara公司的RNAisoPlus提取总RNA,并用NanoDropND-2000紫外分光光度仪测定产物的浓度和纯度。

按PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)的说明书进行逆转录合成cDNA以人β-actin为内参基因,用SYBR®PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)在美国ABI7500系统中进行PCR扩增,实时采集荧光信号用ΔCt值代表基因的相对定量值,用2-ΔΔCt值表示基因表达的差异倍数:ΔCt值=样本基因的Ct值-同组β-action的Ct值,ΔΔCt值=各个样本的ΔCt值-瘤旁正常组织的ΔCt值的平均值引物序列:lnc-PXDN-3:3的上游序列ACCTTCCAGCCTTTGTCCTT,下游序列TACCCGAGCATCCACTTAGG;lnc-PERP-10:2的上游序列TCTCCCAGCCTCTCAAAACAG,下游序列AAACCAAGACCCTTCTACCTCTGA;β-action的上游序列TGACTTCAACAGCGACACCCA,下游序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA1.4统计学方法以SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,计量资料采用独立样本t检验分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果2.1样本总RNA抽提质检结果根据OD260/OD280(260nm代表核酸的值,280nm为蛋白质的值),该比值介于1.7～2.0时判定该样本总RNA质量合格RNAIntegrityNumber(RIN)代表总RNA的完整性,RIN≥7.0为完整性好,RIN在6.0～7.0表示存在部分降解,RIN<6.0表示RNA降解28S/18S≥0.7为合格所有样本RNA质检均合格2.2lncRNA在Kaposi肉瘤中差异表达谱分析通过lncRNA微阵列芯片检测比较Kaposi肉瘤皮损及皮损旁组织之间差异表达的lncRNA表达谱比较Kaposi肉瘤组织及正常组织中的lncRNA表达水平,将差异表达倍数≥1.5且P<0.05的lncRNA定义为差异表达lncRNA,结果筛选出差异表达lncRNA共717个,其中在Kaposi肉瘤组织中上调表达的lncRNA有408个,下调表达的有309个部分差异表达的lncRNA,见表22.3lncRNA差异表达聚类图lncRNA在Kaposi肉瘤组织标本(group1,g1)和瘤旁正常组织标本(group2,g2)中呈离散分布(图1)以差异倍数≥1.5且P<0.05为筛选标准筛选出Kaposi肉瘤组织与正常组织差异表达的lncRNA,其中红色区域表示表达上调和蓝色区域表示表达下调(图2)。

聚类分析直观显示每个样本中不同lncRNA的表达水平,红色表示高表达转录本,绿色表示低表达转录本,灰色部分表示无显著性差异,两组样本中lncRNA的表达存在差异(P<0.05),见图3图1Kaposi肉瘤和瘤旁组织差异表达的lncRNA散点图图2Kaposi肉瘤和瘤旁组织差异表达的lncRNA火山图图3Kaposi肉瘤组织与瘤旁正常组织差异表达的lncRNA聚类分析图2.4qRT-PCR验证为进一步验证基因芯片结果,选取差异lncRNA:lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2,采用qRT-PCR在原有5对组织标本中检测lncRNA表达水平,结果发现表达趋势与芯片结果一致,每个实验进行3个生物学重复,差异均有统计学意义,间接证明芯片分析数据结果的可靠性表3Kaposi肉瘤组织和瘤旁正常组织中2个lncRNA的表达差异2.5差异表达的lncRNA的靶基因预测对于lncRNA靶向位点的预测,我们先依据人类不同lncRNA数据库,结合芯片注释给出的lncRNA编号名称以及坐标,获取差异表达的lncRNA序列选取与lncRNA距离小于10kb的基因作为顺式作用元件(cis-elements)靶基因;再选出与差异表达的lncRNA序列具有互补性或相似性的序列,利用RNAplex计算两序列之间的互补能量,选择e≤-30的序列作为反式作用因子(trans-elements)作用靶基因,部分结果见表4。

然后,根据生物信息学分析,对cis调控及trans调控的靶基因进行KEGG通路注释(图4、5)表4Kaposi肉瘤组织部分差异表达的lncRNAs的靶基因预测图4Cis靶基因富集KEGG通路分析图图5Trans靶基因富集KEGG通路分析图3、讨论Kaposi肉瘤是一种多发性特发性血管肉瘤,好发于双下肢和足部的皮肤,内脏少见,发展缓慢,临床上分为四型:经典型、艾滋病相关型(AIDS-KS)、非洲型和免疫抑制型其病因未明,Kaposi肉瘤病毒感染(KSHV)是目前比较明确的病因之一,它编码了12种成熟miRNA,其中kshv-mir-k12-1和kshv-mir-k12-12在Kaposi肉瘤组织中呈高表达[7],kshv-mir-k12-1-5p可能通过靶向抑制CDKN1A的表达影响Kaposi肉瘤的细胞周期然而,不是所有感染KSHV者都会发生Kaposi肉瘤,人内源性逆转录病毒K(HERV-K)的活化可能起到了一定的促进作用,而且并非所有的Kaposi肉瘤都存在KSHV感染[8]Kaposi肉瘤发生有明确的地区分布和种族差异,在我国主要发生于新疆地区维吾尔族人群中,吴秀娟等[9]对该地区Kaposi肉瘤组织进行miRNA芯片研究,发现了差异表达的miRNA,进一步研究提示miR-126可能是Kaposi肉瘤的一种抑癌基因。

目前研究表明有超过90%的人类基因组可以转录为RNA,但是其中只有2%可翻译为蛋白质,98%的转录产物为不编码蛋白的非编码RNA,如miRNA、lncRNA等近年来非编码RNA成为研究的热点[10],而Kaposi肉瘤中的lncRNA与Kaposi肉瘤的关系研究较少长链非编码RNA(longnoncodingRNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的线性非编码RNA转录本,可通过顺式(incis)或反式(intrans)作用调节来调控靶基因的表达近年来,越来越多的研究证实lncRNA在肿瘤等疾病的发生发展的中发挥着重要作用[11,12,13]本研究通过lncRNA芯片分析了Kaposi肉瘤组织和正常组织中lncRNA表达谱的差异变化,按照表达差异倍数≥1.5倍且P<0.05进行筛选,共得到717个差异表达的lncRNA,其中在Kaposi肉瘤组织中上调409个,下调308个,与正常组织相比,Kaposi肉瘤组织中存在明显的lncRNA差异表达,提示lncRNA可能参与了Kaposi肉瘤的发病过程利用生物信息学技术对差异表达的lncRNA进行靶基因预测,结果显示差异表达的lncRNA可能通过cis和trans两种方式对靶基因进行调控。

同时我们挑选了在Kaposi肉瘤组织中上调表达的lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2通过qRT-PCR在5对样本组织中进一步验证芯片结果的准确性,结果与芯片检测结果一致在Kaposi肉瘤lncRNA网络的KEGG功能注释中发现涉及到Wnt信号通路、泛素化代谢、TGF-β信号通路、p53信号通路等,这些信号通路是重要的细胞增殖、分化与凋亡的关键调节通路,与多种肿瘤密切相关有研究证实乳腺癌中lncRNACRNDE能通过竞争抑制miR-136激活Wnt/β-catenin信号,从而促进肿瘤细胞增殖[15],而lncRNAHIT对TGF-β介导的乳腺癌细胞的侵袭转移具有显著的促进作用[16]胃癌组织中明显低表达的lncRNATUSC7,是p53的直接转录靶点,可以通过抑制miR-23b的方式来抑制肿瘤细胞的生长和增殖[17]也有研究显示lncRNA可促进蛋白泛素化,增强肿瘤细胞的侵袭能力[18]抑癌基因转化生长因子II型受体(TGF-βRII)在Kaposi肉瘤。