第14章核酸的物理化学性质.doc

第十四章 核酸的物理化学性质第一节 核酸的水解一、酸水解糖苷键比磷酸酯键更易水解，特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解二、碱水解通常用于RNA 水解，DNA 的碱水解比较困难三、酶水解DNA 与限制性内切酶：双链DNA 分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断，又可以再连接起来切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2 个分子的ATP这就是分子克隆和DNA 重组技术的基础大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4~6 个碱基的palindrome 顺序它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来DNA 入侵的国防军的作用第二节 核酸的酸碱性质碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式碱基中的H 原子一般不移动，因此很少有亚氨基团在中性pH 条件下，参与氢键的-NH2 基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定碱基核苷核苷酸第三节 核酸的紫外吸收第四节 核酸的变性、复性及杂交一、 DNA 分子的变性DNA 的均一性越高，Tm 的温度范围越小G-C 含量越高，Tm 的值越大，当GC 的含量上升1%，则Tm 上升0.4℃。

马默多蒂(Marmur-Doty)关系式：Tm=69.3+0.41(G+C)%，或GC%=(Tm-69.3)×2.44介质的离子强度较高时，Tm 的值较大酸性条件下，核酸容易脱嘌呤，碱性条件下，核酸容易变性，通常加NaOH 降低Tm 的值尿素，甲酰胺等化学试剂可以降低Tm 的值，称作变性剂DNA 的变性在紫外吸收上的变化：二、复性（一） DNA 浓度与复性时间的关系（二）影响复性速度的因素DNA 的片段越大，复性的速度越慢；DNA 的浓度越高，复性的速度越快；DNA 的重复序列越多，复性的速度越快；溶液的pH 过高或过低，复性的速度均会降低；适当增高溶液的离子强度，复性的速度会增高三） DNA 复性与Cot 分析（四）人DNA 的Cot 曲线哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA 中就插入了长度为350bp 的Alu 序列达50 万份拷贝之多三、DNA 的分子杂交技术分子杂交是将不同来源的核酸分子分别变性，再混合后复性，使不同来源的单链的互补区形成双链的技术通常将其中的一方用放射性同位素或特定的基团（如生物素，地高辛）标记，称作探针，现时的探针多为人工合成的短片段。

若将杂交的另一方直接点到膜上进行杂交，称作点杂交对组织切片或菌落进行处理后再杂交称作原位杂交分子杂交的广泛应用是将样品DNA 用限制性内切酶切割成一定大小的片段，进行变性凝胶电泳，将凝胶电泳形成的DNA 区带转移到膜上再进行杂交，这种技术称作Southern 杂交将RNA 凝胶电泳形成的区带转移到膜上再进行杂交称作Northern 杂交将蛋白质凝胶电泳形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作Western 印迹技术将蛋白质等点聚焦形成的区带转移到膜上再与酶标抗体进行特异反应称作Eastern 印迹技术分子杂交技术在现代生命科学中的应用十分广泛将人工合成的探针用点样机点到玻璃或塑料基片上形成高密度的阵列，将样品DNA 用限制性内切酶切割成一定大小的片段，变性后用荧光基团标记，再进行分子杂交操作，这就是DNA 芯片技术的基本原理用类似的技术可以制成蛋白质芯片按指令在基片上合成探针，可以制成密度特别高的芯片生物芯片技术有非常广阔的应用前景。