雌二醇对人网膜脂肪细胞分泌脂肪细胞因子的研究.docx

    雌二醇对人网膜脂肪细胞分泌脂肪细胞因子的研究    【摘要】目的体外原代培养人大网膜前脂肪细胞，诱导其分化成熟过程中，探讨雌二醇对脂肪细胞分泌瘦素和脂联素的作用方法选取择期开腹手术患者的新鲜脂肪组织，采用胶原酶消化的方法分离培养人大网膜前脂肪细胞，诱导分化至成熟后分别用1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的雌二醇干预24h后收集上清液用酶联免疫吸附法同批检测所收集细胞上清液中瘦素和脂联素蛋白含量结果成功培养人大网膜前脂肪细胞并诱导其分化，分别应用1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的雌二醇作用前脂肪细胞24h，显示：雌二醇对瘦素的分泌均有促进作用（P<0.05），而对脂联素分泌有抑制影响（P<0.05）结论雌二醇促进脂肪细胞分泌瘦素，而抑制脂联素的分泌，为临床治疗肥胖及相关代谢异常疾病提供新的思路关键词】脂肪细胞雌二醇瘦素脂联素脂肪细胞因子（adipocytokine），是由脂肪组织分泌的一系列肽类激素的总称瘦素(Leptin，LEP)是人和动物肥胖基因编码的一种多靶器官、多功能的分泌型蛋白激素，它主要由体内白色脂肪组织合成、分泌，进入血液循环后游离或与瘦素运转蛋白结合通过与定位于中枢和外周多种组织及其多种形式的瘦素受体结合，发挥生物学效应，作为一种机体代谢状态的信号，影响机体许多生理系统及代谢通路。

脂联素（Adiponectin，APN）是迄今发现的唯一单独由脂肪组织分泌、对抗胰岛素抵抗、但却与肥胖成负相关分泌的一种保护性脂肪因子本研究通过体外原代培养人大网膜前脂肪细胞并诱导其分化成熟过程，探讨雌二醇对脂肪细胞分泌LEP和APN的作用1材料与方法1.1主要试剂DMEM/F12培养基购自北京鼎国生物技术有限公司；胎牛血清购自美国英杰生命技术有限公司；牛血清白蛋白购自德国Boehinger公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、甲状腺素、生物素购于美国Sigma公司；生物素标记瘦素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素、瘦素标准品及质控由北京301医院内分泌科实验室惠赠1.2试剂配制基础培养基：DMEM/F-12(1:1)中添加10%胎牛血清和双抗；分化培养基：DMEM/F-12(1:1)中添加胰岛素(0.5μmol/L)、地塞米松(0.2μmol/L)、甲状腺素(0.2μmol/L)、生物素(33μol/L)、泛酸钙(17μmol/L)、转铁蛋白(10mg/L)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.5mmol/L)及双抗1.3组织来源大同市第二人民医院普外科择期开腹手术的患者。

病例筛选标准：无服利尿剂、β受体阻滞剂等干预糖脂代谢的药物史；无全身代谢及内分泌疾病；无吸烟、酗酒史；平均年龄(35.00±10.00)岁，体重指数＜25kg/m2患者及家属知情同意切取大网膜脂肪组织约10g1.4前脂肪细胞的原代培养无菌条件下切取新鲜网膜脂肪组织，用基础培养基冲洗3～4次，剔除结缔组织和可见血管，充分剪碎脂肪组织，移入到含有10ml胶原酶消化液的离心管里，37℃恒温水浴振荡消化1h后，向离心管中再加入适量基础培养基，并用吸管反复吹打使组织块分散，然后依次通过80目和200目的不锈钢筛网过滤，收集滤液将滤液以800g离心5min弃上清，加入基础培养基制成细胞悬液获得的细胞悬液混匀计数，按照104个/cm2的密度接种于24孔培养板中，于37℃，5%CO2培养箱中培养1.5前脂肪细胞分化过程观察接种12～16h后基本完全贴壁，加入含血清的基础培养液继续培养2～4d，换为分化培养液诱导细胞分化，3d后改用不含IBMX的分化培养基诱导，倒置显微镜下观察细胞并照相，用油红O染色以证实细胞分化情况1.6雌二醇对已分化的前脂肪细胞分泌LP和APN的影响细胞接种及干预方式同诱导分化至第9天后收集细胞上清作为干预前基线值，用无血清基础培养基冲洗细胞并分组干预细胞：对照组；②含终浓度为1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的雌二醇(Estradiol,E)的基础培养基干预组。

其中每组3孔，干预细胞24h后收集上清作为处理值，比较LEP和APN蛋白水平变化1.7分别采用酶联免疫吸附法检测LEP和APN蛋白水平每孔加入100μL含抗原的碳酸盐包被液，4℃冰箱过夜存放次日洗板1次后每孔加入400μL阻断液，室温1h后洗板2次后待用每孔再加50μL上清液和50μL的生物素化的单抗，中间两组加入稀释后的标准瘦素浓度的质控血,室温下孵育2h，洗涤4遍后每孔加亲和素-辣根酶100μL孵育40min，洗涤4遍后TMB底物显色，10min后2mol/L硫酸中止反应，450nm测定波长和620nm参考波长酶标仪下读数1.8统计学处理采用spss13.0软件进行单因素的方差分析，组间比较采用t检验，结果用x-±s表示，P<0.05为差异有统计学意义2结果2.1原代培养人前脂肪细胞分化的形态学观察接种12h后可以基本贴壁，初为体积较小类圆形，后细胞逐渐变为梭形或多角形，显微镜下观察形态类似成纤维细胞并开始迅速增殖待细胞铺满培养板的70%以上后换为分化培养基诱导细胞分化在分化的第4-5天即可观察到细胞内出现反光的脂质小滴（见图1），随着分化的进展含脂滴的细胞数明显增多，更多细胞中小脂滴融合成大脂滴。

用油红O染色细胞着红色可以反映细胞分化程度（见图2）2.2酶联免疫吸附法检测瘦素和脂联素蛋白水平分别应用1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的E作用前脂肪细胞24h，结果显示：E对LEP的分泌均有促进作用（P<0.05），而对APN分泌有抑制影响（P<0.05）3讨论在生理剂量激素的存在下可以形成正常的脂肪分布状态，但是因老化和性腺切除后引起的性激素水平的降低往往导致中心性肥胖的形成Abate研究证实[1]，脂肪分布方式对2型糖尿病和冠心病等代谢性疾病的发展有重要的意义体脂分布有性别差异性，绝经前女性低内脏脂肪使她们比男性和绝经后女性的代谢性疾病患病率低;绝经后妇女同经前妇女相比网膜的脂肪细胞变得更大，这些均提示性激素在调节体脂分布上有重要的作用Anderson等[2]等研究提示E刺激网膜前脂肪细胞增殖率有剂量依赖性，雌二醇3个浓度在72h时段都增加增殖率，10-7mol/L有最大增殖效应Machinal等[3]分别体外培养男性和女性的脂肪细胞，通过雌雄激素短期干预24h发现，在女性，10-8－10-7mol/L的17β雌二醇可以明显增加obmRNA表达和瘦素水平的分泌，雌激素的前体10-7mol/L的睾酮和10-9mol/L的双氢睾酮也能够诱导瘦素的分泌。

这些作用都可被雌激素受体拮抗剂阻止而在男性，只有10-7mol/L的双氢睾酮可以诱导瘦素分泌和obmRNA表达的降低此项结果与本试验基本一致APN是一种由apM1基因编码的脂肪组织特异性的血浆蛋白，具有抗炎、抗糖尿病和抗动脉粥样硬化的特性[4]YukoMurase[5]运用雄激素和雌激素拮抗药雷洛昔芬干预3T3-L1脂肪细胞发现雷洛昔芬可以通过诱导脂肪细胞的分化而促进APNmRNA表达的升高，而E则发挥着相反的作用与该研究结果相符本实验表明，E促进人大网膜前脂肪细胞增殖，分泌LEP水平增高，抑制APN的分泌，提示雌二醇可能使内脏脂肪增多，从而引起胰岛素抵抗及相关代谢性疾病的发病率增高在一定程度上应用雌激素拮抗剂临床治疗肥胖及相关代谢异常疾病提供新的思路参考文献[1]AbateN.Insulinresistanceandobesity.Theroleoffatdistributionpattern.DiabetesCare,1996,19:292?94.[2]AndersonLA,McTernanPG,BarnettAH,etal.Theeffectsofandrogensandestrogensonpreadipocyteproliferationinhumanadiposetissue:influenceofgenderandsite[J].JClinEndocrinolMetab,2001,86:5045-5051.[3]MachinalQF,DieudonneMN,PecqueryR,etal.Directinvitroeffectofandrogensandestrogensonobgeneexpressionandleptinsecretioninhumanadiposetissue[J].Endocrine,2002,18:179-184.[4]HattoriY,AkimotoK,GrossSS,etal.Angiotensin-Ⅱinducedoxidativestresselicitshypoadiponectinaemiainrats.Diabetologia,2005,48:10066-10074.[5]MuraseY,KobayashiJ,etal.Raloxifenepromotesadipocytedifferentiationof3T3-L1cells.EurJPharmacol.2006,5(24):1-4.  -全文完-。