RNA结合蛋白与转录后调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA结合蛋白与转录后调控,王文恭,mRNA turnover,Translation level,Post-translation level,Transcription level,Gene,Regulation,DNA and chromatin levels,Post-transcriptional level,Maturation,mRNA export,Regulatory factors for mRNA decay and translation,RNA binding proteins,microRNAs,RNA binding proteins(RBPs),RNA结合蛋白种类很多，估计占细胞编码蛋白6-8%者为RNA结合蛋白,但迄今只有为数不多的几种RNA结合蛋白（如HuR，AUF1，TTP，TIA1，CUGBP2等）被证实可特异参与mRNA稳定性、翻译、或其它层面的基因调控HuR,Hu/ELAV RNA 结合蛋白家族（包括HuA/HuR，Hel-N1，HuC，HuD）,的主要成员。

与其它成员仅表达于神经细胞不同，HuR几乎在所有组织,都有表达主要位于细胞核，但可穿梭于细胞浆/核间，且只有细胞浆HuR,可调控mRNA稳定性（及翻译）核内HuR则与mRNA成熟及export有关结合所有三类AREs结合后的结局主要为稳定目标因此也被,称为mRNA 稳定因子结合并稳定VEGF,COX-2,p21,cyclin A,cyclin B1,c-fos,TNF，IL-1，,MyoD，Myogenin，bcl-2等mRNA因此可调节应激反应，细胞周期，肿瘤，,分化，调亡等过程HuR也可结合目标并调节其翻译1）调控翻译效率，如 p53，p27 mRNA,c-myc2）调控mRNA export,如 CD83，c-fos,COX-2AUF1,也叫,HnRNPD,（,heterogeneous nuclear,ribonucleoprotein,D).,主要位于核内，但可穿梭于核,/,细胞浆间，结合,I,，,II,类,AREs,结合目标,mRNA,后使之不稳定（易于降解），如,P21,，,CyclinD1,，也可使目标稳定，如,TNF-alpha,TTP,与HuR及AUF1不同，TTP主要位于细胞浆，结合II类AREs。

结合目标后主要使目标不稳定如：COX-2，TNF-alpha,GM-CSF,等Effect of ARE-BPs on the stability and translation of ARE-containing mRNAs,ARE-BPs mRNA stability Protein expression,Translational efficiency Abundance,Increase Decrease Increase Decrease Up regulated Down regulated,AUF1 c-myc(,42,)c-myc(,46,)GMCSF(,55,),c-fos(,42,67,)c-fos(,53,)IL-3(,55,),PTH(,56,)p21(,48,),GMCSF(,42,)Cyclin D1(,48,),TNF-alpha(,42,)GMCSF(,53,54,),IL-3(,55,),HuR c-fos(59,63,67)p53(99,137)TNF-alpha(139)p21(,69,)TNF-alpha(,139,),MyoD(,68,)Cox-2(,139,)Cyclin A(,70,),p21(,48,68,69,)Cyclin B1(,70,),Cyclin A(,70,)NOS II/iNOS(,64,),Cyclin B1(,70,)GMCSF(,55,),Cyclin D1(,48,)Cox-2(,71,173,),NOS II/iNOS(,64,)IL-3(,55,),GMCSF(,59,)VEGF(,173,),TNF-alpha(,65,74,139,)p53(,99,137,),Cox-2(,71,139,),IL-3(,55,66,),VEGF(,62,),Myogenin(,68,),Hel-N1 TNF-alpha(,74,)NF-M(,73,)NF-M(,73,),GLUT1(,72,)GLUT1(,72,)GLUT1(,72,),HuD GAP-43(,75,77,)GAP-43(,75,76,),TTP c-fos(,90,)GMCSF(,81,),GMCSF(,18,81,83,85,91,)TNF-alpha(,80,),TNF-alpha(,18,81,83,86,89,90,)IL-2(,82,),Cox-2(,87,)IL-3(,88,),IL-2(,82,90,),IL-3(,18,66,83,84,88,),BRF1 TNF-alpha(,89,93,)GMCSF(,55,),IL-3(,55,92,93,)IL-3(,55,),TIA-1 TNF-alpha(,120,)TNF-alpha(,120,),Cox-2(,121,)Cox-2(,121,),KSRP c-fos(,90,93,)NOS II/iNOS(,102,),NOS II/iNOS(,102,),TNF-alpha(,90,93,),IL-2(,90,93,),c-jun(,93,),CUG-BP2 Cox-2(,150,)Cox-2(,150,)Cox-2(,150,),Nucleolin bcl-2(,175,),TINO bcl-2(,176,),PAIP2 VEGF(,177,)VEGF(,177,),Interaction of the factors involving in post-transcriptional regulation,1.RNA结合蛋白相互作用。

如，HuR与AUF1均可结合于p21 与cyclin D1 3UTR，但二者有竞争，且功能相反2.RNA结合蛋白与microRNA间相互作用如，HuR与let-7,miR-122,TTP与miR-16AU-rich Elements(AREs),1.主要指位于,3-,非翻译区的富含AU的序列2.被RNA结合蛋白识别，结合3.主要为mRNA 不稳定元件，是mRNA 在完成使命后快速降解的结构基础4.依构成分为三类,1）含1-5个分散的AUUUA2）至少有两个Overlapping UUAUUUA(U/A)(U/A).,依AUUUA的重复方式分为5类，IIA，IIB，IIC，等3）富含U，但无AUUUA注：,除一级结构外，mRNA的二级结构也与RNA-蛋白质相互作用密切相关如，约70-80%HuR或AUF1结合序列具有相似的二级结构,mRNAs ARE-BPsClass Motif Examples I,1 to 5个散在 AUUUA c-myc,AUF1,HuR，Hel-N1，HuC，HuD，AUH，GAPDH，Hsp70,c-fos,AUF1，HuR，Hel-N1，HuD，KSRP，AUH,Beta1-AR AUF1 PTH AUF1 Interferon-gamma GAPDH，Hsp70 MyoD HuR p21 AUF1，HuR，HuD Cyclin A HuR Cyclin B1 HuR Cyclin D1 AUF1，HuR PAI-2 HuR NOS II/iNOS HuR，KSRPIIA(AUUU)5A GMCSF,AUF1，HuR，Hel-N1，TTP，BRF1，TIAR，KSRP，AUH，GAPDH，Hsp70，hnRNP-A1，hnRNP-C,TNF-alpha,AUF1，HuR，TTP，BRF1，TIA-1，TIAR，KSRP,IIB(AUUU)4A Interferon-alpha,hnRNP-A1，hnRNP-A2,hnRNP-A3,IIC(A/U)(AUUU)3A(A/U)Cox-2 AUF1,HuR,HuD,TTP,TIA-1,TIAR,hnRNP-A1，hnRNP-A2,hnRNP-A3,，CUDBP2 IL-2 AUF1，HuR，HuD，TTP。

Hsp70，Hsp110，,hnRNP-A1,IL-3 HuR，BEF1，AUH，Nucleolin，TINO bcl-2 AUF1，HuR，VEGF HuR HuC，HuD，PAIP2IIINo AUUUA,c-jun,TIAR，CUGBP1,U-rich region GLUT1,Hel-N1，hnRNP-A2，hnRNP-L,p53 HuR，Id,Hel-N1,hsp70 HuR Myogenin HuR NF-M,Hel-N1,GAP-43 HuD A matrix presentation has been used to represent the identified associations between ARE-BPs and ARE-containing mRNAs.The mRNAs containing identified functional AREs are listed vertically and are grouped according to the classifications proposed by(,24,)and(,26,).The ARE-BPs are displayed horizontally.Where appropriate the different names used to denote the same protein or mRNA are given.The lists of ARE-containing mRNAs and of ARE-BPs are not exhaustive and only direct interactions have been considered.Where the experimental methods used identified endogenous interactions,these are indicated by an asterisk.Data on the experimental methods are presented in the Supplementary data.Numbers correspond to listed references.,Interaction between ARE and RBPs,RNA-蛋白质相互作用(结合)的特点,可在细胞核,也可在细胞浆,发生在核与胞浆的结合功能截然不同,如在胞浆与翻译及mRNA稳定性有关,在核可能与拼接或成熟有关.,RNA结合蛋白对目标的序列要求不如DNA 结合蛋白般严格.,结合部位大多在3-UTR,少数在5-UTR,绝少见于CDS.,mRNA稳定性（turnover）研究的特殊技术,蛋白质-RNA结合试验：,1）目标Transcript 的体外转录与标记,2）细胞浆抽提物的制备。

3)EMSA(gel-shift,supershift),4)rChip,pull-down assays(using paramagnetic streptavidin dynabeads,biotinyl-labeled transcripts),mRNA半衰期测定,基本思路:终止转录后,收取不同时间点之RNA,定量分析RNA降解速率.,1）用ActinomycinD终止转录,2）Tet-off/on（或类似）报告基因系统,3)in vitro,RNA降解分析,Tet-on,system is activated in the pres。