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实验六 细胞器的分离与观察 细胞核的分离与观察 线粒体的分离与观察,一、实验目的,了解细胞器的分离原理 掌握差速离心和密度梯度离心技术,二、实验原理,细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来 细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段1)匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。

由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.,,(3)分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定Unna染色法（甲基绿-派洛宁染色）,1899年Pappenheim 首创了甲基绿-哌洛宁（mehtyl-green-pyronim）染色法1902年Unna对这一方法进行了改良1940年Brachet研究证明用甲基绿—哌洛宁对DNA和RNA有选择性的染色效果核酸是酸性的，它们对于碱性染料甲基绿和派洛宁的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性DNA被甲基绿染成绿色，RNA被派洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来 中性红-詹纳斯绿染色,詹纳斯绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积粒体膜上由于线粒体内具有细胞色素氧化酶系，能使詹纳斯绿保持在氧化状态（淡蓝绿色），在胞质区詹纳斯绿则被还原为无色中性红的阳离子可与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色离心技术概述,离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离技术。

离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的力与角速度和旋转半径有关 相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”离心力g＝1.11×10-5n2r r为离心机中轴到离心管远端的距离 n为离心机每分钟的转速（r/min） 1000g=9.8牛（N）,离心技术类型,离心技术可用于细胞器的分离 离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心,（一）差速离心 （differential centrifugation）,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器差速离心法是指有低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低速中沉淀，再用较高的转速将原先悬浮于上清夜中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离 但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心十是均匀分布于整个离心介质中的，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，需经反复悬浮和离心加以纯化二）密度梯度离心 （density gradient centrifugation）,A等速度沉降，B等密度沉降 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

密度梯度离心法是用密度具有梯度的介质来替换离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度的低的在上层，浓度高的在底层将细胞匀浆加在最上层，随后离心这样，不同大小、形态、密度的颗粒就会以不同的速度向下移动，集中到不同的区域，可以分别收集 细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能，保持酶的活性，避免细胞器的聚集三、材料和试剂,材料：小鼠的肝脏 器材：高速冷冻离心机、天平、显微镜、吸管、Eppendorf管、冰块、冰盒、载玻片、盖玻片、烧杯、玻璃匀浆器 试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、 0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、 95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、 甲基绿-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液四、实验方法与步骤,1.细胞核的分离,（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤纸吸干称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。

将烧杯中的悬浮肝组织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行匀浆完毕,移入1.5ml离心管中2）离心：低温离心机中进行 每次离心前一定要在天平（托盘天平）上将两离心管配平第一次以600g离心10min将其上清夜移入Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待后面使用(分离线粒体)沉淀使用1ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次1000g离心10min3）纯化：将沉淀用5倍体积0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液混悬，用长针头注射器再混悬液下轻轻加入4倍体积0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液尽量使两种溶液明显分层以1500g离心15～20min弃上清液，沉淀即为经过纯化的细胞核，用PBS溶液悬浮，4˚C保存4）鉴定：将分离纯化的细胞核制成涂片，空气干燥将干燥的涂片浸入95％乙醇溶液固定5min，晾干，滴加甲基绿-派洛宁染液染色20～30min，丙酮分色30 s，蒸馏水漂洗，滤纸吸干水，镜检 核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色2.线粒体的分离,(1)分离:将分离细胞核时收集的上清液以10000g离心10min。

沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮,10000g离心10min,反复2次 (2)鉴定:在干净的载玻片中央滴加1～2滴中性红-詹纳斯绿染液,用牙签挑取沉淀物均匀涂片盖上盖片,染色5min,镜检 线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状五、 实验结果,核DNA呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色 线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状 观察每个视野中所见完整细胞核和线粒体的数量及纯度六、实验报告,1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？ 2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度要获得高活性的线粒体，粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法 3. 分离介质0.25mol/L 及0.34mol/L 缓冲蔗糖溶液哪一种在下层? 有什么作用?,。