大学生物化学教学课件比色的原理.ppt

Quantitative determination of proteinsThe Folin Ciocalteu(Lowry method)The Folin Ciocalteu(Lowry method)第1页，共16页PrincipleReagents of Lowry method consist of two parts:1.Alkaline copper reagent:1.Alkaline copper reagent:Peptide bonds in Peptide bonds in protein can react with alkaline copper reagent to protein can react with alkaline copper reagent to give color production.give color production.Biuretcolor第2页，共16页2.Folin reagent:2.Folin reagent:主要成分是磷钼酸盐主要成分是磷钼酸盐主要成分是磷钼酸盐主要成分是磷钼酸盐磷钨酸盐磷钨酸盐磷钨酸盐磷钨酸盐Monovalent copper ion and the radical groups Monovalent copper ion and the radical groups of tyrosine,tryptophan,and of tyrosine,tryptophan,and cysteine,phenylanine react with Folin reagent cysteine,phenylanine react with Folin reagent to produce an product that becomes reduced to produce an product that becomes reduced to molybdenumto molybdenum（钼）（钼）/tungsten/tungsten（钨）（钨）blue.blue.Folin Folin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色的还原型混合物（钼兰和钨兰的混合物）。

在和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色的还原型混合物（钼兰和钨兰的混合物）在和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色的还原型混合物（钼兰和钨兰的混合物）在和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色的还原型混合物（钼兰和钨兰的混合物）在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比第3页，共16页此外，蛋白质肽键发生烯醇化反应，能使钼离子在此外，蛋白质肽键发生烯醇化反应，能使钼离子在pH=10pH=10时鳌合在时鳌合在肽结构中形成复合物（皆可与铜离子络合，络合后易于使肽释肽结构中形成复合物（皆可与铜离子络合，络合后易于使肽释放电子，使酚试剂还原），从而使电子转移到显色剂上，大的放电子，使酚试剂还原），从而使电子转移到显色剂上，大的加强了酚试剂蛋白质的敏感性加强了酚试剂蛋白质的敏感性LowryLowry法即利用蓝色深浅（对应蛋白质的浓度），法即利用蓝色深浅（对应蛋白质的浓度），法即利用蓝色深浅（对应蛋白质的浓度），法即利用蓝色深浅（对应蛋白质的浓度），测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定蛋白质的含量。

第4页，共16页Procedure step step 1:1:Prepare 7 tubes for standard,unknown and blank,Prepare 7 tubes for standard,unknown and blank,add reagents as follows.add reagents as follows.Unit:mlUnit:ml No.of tube 1 2 3 4 5 UK B No.of tube 1 2 3 4 5 UK B Protein standardProtein standard 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -Unknown sample -1.0 -Unknown sample -1.0 -H H2 2O 0.8 0.6 0.4 0.2 -1.0O 0.8 0.6 0.4 0.2 -1.0Alkaline copper Alkaline copper Reagent 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0Reagent 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Mix Mix immediately!immediately!(very important)(very important),stand for 10 min,stand for 10 min.Folin reagent 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0Folin reagent 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0第5页，共16页。

Step2:Step2:stand for 20 min,read the absorbance at 620 nm,use B as stand for 20 min,read the absorbance at 620 nm,use B as control.control.Step 3:Step 3:plot the data of standard to obtain a standard curve plot the data of standard to obtain a standard curve(以蛋白质以蛋白质浓度为横坐标浓度为横坐标,吸光度为纵坐标吸光度为纵坐标).).The original concentration of protein standard:The original concentration of protein standard:250 g/ml 250 g/ml The concentration of protein standard in each tube should be The concentration of protein standard in each tube should be caculated as:caculated as:250 g/mlg/ml X X X Xml5ml第6页，共16页。

Result1.Plot the data of standard to obtain a standard curve (以蛋白质浓度为横坐标,A为纵坐标为纵坐标).2.Find out the protein concentration of the 2.Find out the protein concentration of the unknown on the standard curve.unknown on the standard curve.3.Calculate the concentration of the unknown sample(ug/ml)第7页，共16页For example:standard curve1020304050g/ml0.10.20.30.40.5A6200Ug/mlUg/ml 10102020303040405050A A620620(是直线是直线,不是折线不是折线!)!)第8页，共16页Find out the protein concentration of the unknown on the curve.0A620proteinconcentration(ug/ml)unknown第9页，共16页。

CalculationCalculation the concentration of unknown sample(ug/ml).e.g.？5 第10页，共16页涉及的操作:分光光度仪的使用分光光度仪的使用分光光度仪的使用分光光度仪的使用第11页，共16页分光光度计结构:光源 单色光器单色光器 狭缝 吸收池检测器第12页，共16页比色的原理比色的原理分光光度计分光光度计 紫外紫外:400 nm:750 nm:750 nm 由光源产生复合光，通过色散系统，分解为波长连续的单色由光源产生复合光，通过色散系统，分解为波长连续的单色光，单色光通过生化样品时，光，单色光通过生化样品时，一部分被吸收一部分被吸收,一部分透过一部分透过，通过，通过检测透射光的强度检测透射光的强度I I和入射光的强度和入射光的强度I I0 0，透射率，透射率T=I/IT=I/I0 0,透射光的强度和溶液的浓度有一定的比例关系，即符合朗伯透射光的强度和溶液的浓度有一定的比例关系，即符合朗伯-比尔比尔定律定律(Lambert-Beer Lambert-Beer)第13页，共16页T T=I I/I I0 0 Log LogI I0 0/I I=KCLKCL A A=KCLKCL 其中：其中：T T透射比透射比I I0 0入射光强度入射光强度 I I 透射光强度透射光强度A A吸光度吸光度 K K 吸收系数吸收系数L L 溶液的光程长溶液的光程长 C C 溶液的浓度溶液的浓度 从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光程从以上公式可以看出，当入射光、吸收系数和溶液的光程长不变时，透射光与溶液的浓度成正比。

长不变时，透射光与溶液的浓度成正比第14页，共16页分光光度仪操作说明分光光度仪操作说明分光光度仪操作说明分光光度仪操作说明1.1.预热：开机预热预热：开机预热3030分钟后，才能进行测定工作分钟后，才能进行测定工作2.2.调整波长：使用波长调节钮，目光垂直观察波长指示窗，选择波调整波长：使用波长调节钮，目光垂直观察波长指示窗，选择波长3.3.放入样品，设置空白对照样品槽中的样品位置最靠近测试者的为放入样品，设置空白对照样品槽中的样品位置最靠近测试者的为“0 0”位置依次向外拉出相应为位置依次向外拉出相应为 1 1 2 2 3 3 位置，当拉杆到位是位置，当拉杆到位是有定位感（卡他声）空白对照放入有定位感（卡他声）空白对照放入0 0位4.4.调调0%T0%T：确定单色光经过空白对照样品，选择投射比（：确定单色光经过空白对照样品，选择投射比（T T）模式打开试样盖，然后按调打开试样盖，然后按调0%0%键，调整零位键，调整零位5.调调100%T100%T：轻轻盖下试样盖，调整：轻轻盖下试样盖，调整100%T100%T6.重复重复4 4，5 57.7.读吸光度值：选择吸光度模式，依次向外拉出相应为读吸光度值：选择吸光度模式，依次向外拉出相应为 1 1 2 2 3 3 位置，液晶屏显示数值即为该样品吸光度值。

位置，液晶屏显示数值即为该样品吸光度值精确到小数后精确到小数后3 3位数字第15页，共16页第16页，共16页。