乳腺癌ba46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫.doc

乳腺癌BA46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫【摘要】 目的 探讨以腺相关病毒为载体，乳腺癌抗原BA46基因转染树突状细胞（DCs）诱导特异细胞免疫的可行性方法 取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DCs前体细胞），以AIMV培养基于6孔板培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞，取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带BA46基因的重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo，对照组以293细胞裂解物冲击，两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）、白细胞介素4（IL4）、肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导DC前体细胞成熟第7天，收集细胞(DCs)，显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析DCs的表面标志CD80、CD86、CD40、CD83、HLADR的表达情况；另取该DC与T细胞按比例混合，含5%人血清蛋白的AIMV为培养基，同时加入IL2与GMCSF，共育7天，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，用3HTdR掺入法检测转染BA46制备的DC刺激自体淋巴细胞增殖能力；取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，采用51Cr释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪分析CTL 细胞中IFNα和 IL4的表达情况。

结果 BA46基因转染制备的DCs形态正常，表面标志CD80、CD86、CD40、CD83、HLADR均表达良好，具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力，且能诱导抗原特异性和MHC限制性的细胞免疫结论 BA46基因转染法成功制备DCs，并诱导特异的细胞免疫，为乳腺癌的DCs基因疗法打下基础 【关键词】 树突状细胞 BA46 腺相关病毒 乳腺癌　　0 引言 　　树突状细胞(DCs)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，采用体外培养DCs，特异肿瘤抗原刺激制备DCs疫苗，免疫机体从而激发特异的细胞免疫有望成为一种理想的肿瘤治疗手段[1, 2]此疗法的关键是获得特异的肿瘤抗原，并将该抗原转导DCs乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，BA46几乎在所有的乳腺癌细胞高表达，而在乳腺以外的正常组织内不表达[36]，以其抗原肽免疫转基因鼠，可在其身上诱导出特异的细胞免疫[7]因此它可做为乳腺癌DCs治疗非常理想的肿瘤抗原本研究以腺相关病毒（AAV）为载体，成功制备高滴度的携带BA46基因的重组腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo病毒）[8]在此基础上，取人外周血单个核细胞（DCs前体细胞），体外培养，以rAAV/BA46/Neo病毒转染DCs前体细胞，GMCSF、IL4和TNFα诱导DCs成熟，加入T细胞，GMCSF和IL2诱导，最终获得针对BA46的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并检测该CTL对BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T的杀伤效果及CTL 细胞中IFNγ和IL4的表达情况，探讨此基因转染法制备DCs，诱导特异细胞免疫的可行性。

　　1 材料与方法　　１．１ 病毒 重组乳腺癌BA46基因腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo）由作者于阿肯色大学医学院基因治疗中心制备，病毒滴度为1×1010个病毒颗粒/ml[8]　　１．２ 主要试剂 AIMV培养基购自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自Sigma公司；AIMV (R)无血清淋巴细胞培养基购自GIBCO Invitrogen公司；GMCSF购自Immunex公司；IL4购自R&D SYSTEMS公司；FITC标记的AntiCD40抗体购自Immunotech公司；FITC标记的antiCD80、antiCD83、antiHLADR、anti IFNγ和PE标记的antiIL4均购自BectonDickinson公司；FITC标记的antiCD86购自Pharmingen公司　　１．３ 主要仪器 流式细胞仪为美国Becton Dickinson 公司产品；液闪计数仪为美国Backman公司产品　　1．4 人外周血DC的培养 取健康人外周血50ml，Ficoll分离，收集淋巴细胞，以AIMV为培养基，调节细胞浓度为109/ml，培养于6孔板，每孔2.5ml，在 37℃、5% CO2孵箱中培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮的淋巴细胞，取贴壁的单个核细胞，每孔加2.5ml含GMCSF（终浓度为800U/ml）的AIMV培养基，将细胞分为基因转染组和对照组(未感染病毒组)，基因转染组每孔加rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感染5h后换液为每孔3ml含GMCSF（终浓度为800U/ml ）的AIMV培养基，对照组每孔只加293细胞冻融液0.5ml。

两组细胞均于第2天半量换液，于第3天全量换液为含GMCSF（终浓度分别为800U/ml）和IL4（终浓度为1 000U/ml）的AIMV培养基而后隔天半量换液，培养基均为含GMCSF（终浓度分别为800U/ml）和IL4（终浓度为1 000U/ml）的AIMV 第5天，除了GMCSF和IL4外，还加入TNFα（终浓度为20ng/ml）第7天，收集细胞，计数，光学显微镜下观察DCs形态　　1.5 CTL的诱导 在6孔板内，以含5%人血清的AIMV为培养基，按DCs∶T细胞＝1∶20的比例混合DCs和T细胞，同时加入GMCSF（终浓度分别为800U/ml）和IL2（终浓度为200U/ml），共培养7天，期间每隔1天均半量换液　　1.6 混合淋巴细胞反应(MLR) 取上述外周血分离非贴壁细胞置培养瓶中，用含终浓度500u/ml 的IL2，10%人AB血清的AIMV培养液于37℃、5% CO2培养箱中培养待DC成熟后，将非贴壁细胞加在分别取培养7ｄ的基因转染组DCs以及培养同样时间对照组DCs用25μg/ml的丝裂霉素C在37℃孵育45min，PBS液洗3次，用AIMV培养基悬浮。

分别以1×104/孔、5×103/孔和2.5×103/孔，将DCs加入96孔板中，每组各3个复孔，每孔再加入自体Ｔ细胞1×105细胞/孔，终体积为200μl37℃，5% CO2培养96ｈ终止培养前18ｈ加入3HTdR，终浓度为1μC/ml，同时设阴性对照组（淋巴细胞对照组，NDC组）及本底组收集细胞,液闪计数仪检测cpm值，并计算刺激指数SI，SI=(实验组cpm值-本底组cpm值)/( 阴性对照组cpm值-本底组cpm值)，结果用3孔均值表示　　1.7 FACS分析所制备的DC的表面标志和CTL 细胞中IFNγ 和IL4的表达情况[9] 分别取细胞数为106/管的基因转染组DCs和对照组DCs置于流式细胞仪专用试管中，每组取4管，PBS洗涤2遍后，100μl重悬细胞，分别加入下列FITC标记的鼠源性单抗：对照isotype、antiCD40、antiCD80、antiCD86、antiCD83、antiHLADR，避光反应45min，PBS洗涤2遍后，流式细胞仪检测其细胞表面标志表达情况参照Pala等[9,11]的方法处理诱导的CTL，加入终浓度分别为50ng/ml和500ng/ml的PMA和Ionomycin，在37℃的CO2孵箱培养6h，收集细胞，计数。

室温下，2%聚甲醛处理20min固定细胞，以含1% BSA/0.5%皂甙的PBS液，室温下处理10min，加入对照isotype和FITC标记的鼠源性单抗antiIFNγ以及对照isotype和PE标记的鼠源性单抗antiIL4，流式细胞仪检测其IFNγ、IL4表达情况　　1.8 51Cr释放法测量DC激活的T细胞对BA46阳性细胞株的杀伤效率[11] 分别以基因转染组ＤＣ激活的T细胞和对照组ＤＣ激活的T细胞为效应细胞，收获对数生长期的BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，取0.5ml细胞悬液，加入100uCiNa251CrO4，37℃共育2h洗涤后稀释至106/ml，在U形板中加入100ul细胞悬液，按照20∶1的效靶比加入CTL细胞37℃共育6h收获100μl上清，γ计数仪计算，同时设51Cr自发释放组及完全释放组按下列公式计算杀伤率： 　　细胞毒活性（%）＝试验组CPM值－自发释放CPM值最大释放CPM值－自发释放CPM值×100% 　　同时取K562细胞为靶细胞进行同样的细胞毒试验以研究T细胞的非特异杀伤情况在基因转染组CTL杀伤Hs578T的细胞毒试验中增加一组实验，即靶细胞与Na251CrO4共育并洗涤后，加入HLAI类抗体W6/32（终浓度为50μg/mL）共育1h，使其MHC受到封闭后，再进行细胞毒试验，研究T细胞杀伤的MHC限制性。

　　2 结果　　2.1 携带有BA46基因的重组rAAV/BA46/Neo病毒结构示意图 AAV的rep及cap基因被BA46和Neo基因取代，保留两端的反向未端重复序列（ITR），BA46基因采用P5启动子，Neo基因采用SV40启动子，见图1　　图1 携带有BA46基因的重组rAAV/BA46/Neo病毒结构图（略）　　2.2 基因转染组成熟DCs形态 第7天，光镜下观察基因转染组DCs，可见DCs(图中箭头所示)，外形不规则，细胞表面有大量长短不一的突触，呈现典型的DC形态，见图2BA46基因成功转染DC并表达见相关文章[7]　　图2 基因转染组成熟DC形态（略）　　2.3 FACS分析两组DC表面标志表达情况 FACS结果显示，基因转染组DCs共刺激因子CD80（B71）、CD86（B72）、CD40、CD83、HLADR的表达比例分别为78%、83%、79%，86%、92%，均高于对照组DC的15%、64%、53%、74%、89%　　2.4 混合淋巴细胞反应(MLR)情况 基因转移组DCs能明显促进T细胞增殖，其诱导自体CTL的刺激指数（SI）明显高于裂解物刺激组DCs诱导自体CTL的刺激指数, 见表1。

　　表1 两组DCs诱导CTL的刺激指数（略）　　2.5 FACS分析两组DCs激活的T细胞中IFNγ和 IL4的表达情况 FACS分析两组DCs激活的T细胞亚群中，基因转染组的IFNγ和 IL4表达分别为23.8%和1.7%，而对照组DC激活的T细胞的IFNγ和 IL4表达分别为19.4%和13.2%　　2.6 51Cr释放法测量DCs激活的T细胞的杀伤效率 DCs激活的T细胞的细胞毒试验结果, 见表2　　表2 DC激活的T细胞的杀伤效率（略）　　*与对照组相比P＜0.001　　由表1可知，基因转染组T细胞对BA46阳性的靶细胞Hs578T有明显的杀伤（48.5%），而裂解物刺激组T细胞对同样靶细胞无明显杀伤（7.8%），两者比较有显著性差异而且，当加入MHCI类抗体W6/32时，基因转染组T细胞对Hs578T的杀伤率明显下降，仅为12.3%，说明MHCI类抗体可封闭该杀伤活性，杀伤具有MHC限制性；当靶细胞是BA46阴性的K562时，该T细胞对其无明显杀伤，仅为8.2%，说明了此基因转染组所诱导的T细胞对Hs578T的杀伤具有BA46抗原特异性　　3 讨论 　　乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，DCs瘤苗有望成为该病一种全新的治疗手段，已有采用DC瘤苗治疗乳腺癌的临床试验正在进行之中[10]。

制备DC瘤苗的方法常用有抗原肽直接冲击和抗原基因转染等方法，而抗原肽直接冲击存在一定的不足：（1）抗原肽有一定的半衰期（比如t1/2[Her-2/neu]≤30min），不利于多次刺激；（2）目前使用的抗原肽大多来源于细菌表达的基因工程。