克隆载体与表达载体.doc

克隆载体克 隆 载 体基本性质基本特征（或载体的构建）原理机制常用的载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主 复制；不相容性；可转 移性（基因工程中采用 非接合性质粒）（1） 具有合适的复制起始位点（ ORI）（2） 具有合适的选择性标记基因（ 3） 若干限制性切酶的单一位点（ 4）具有 较小的分子量和较高的拷贝数当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体 菌才能生长不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能 在含有抗菌素的培养基 （选择培养基）中生长抗 菌素选择原理）PSC101ColE1PBR322 pUC18 pUC19 TA载体噬 菌 体 载 体入噬 菌体其DNA两端的5'末端 各带有12个碱基的互补 单链，即cos位点有 可替代区，即非必需区 用外源DNA片段替代这 个区域，不会影响噬菌 体颗粒的形成1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因c I失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型 入 噬菌体在带有 P2原噬菌体的溶源性 E.coli中 的生长会受到限制的表型， 称作Spi+ ，即对P2噬菌体的干扰敏 感）1）通过裂解过程增殖载体 2）载体与外源DNA的酶切3）外源DNA与载体的连接4）重组噬菌体的体外 包装5）包装噬菌体颗粒的感染 6）筛选（入噬菌体载体的克隆原理）插入式载体置换型载体（取代型载 体）M13噬 菌体 载体M13噬菌体的基因组为 单链DNA。

噬菌体颗粒 的大小受其DNA端点制 约的，不存在包装限制 只感染雄性大肠杆菌基因间隔区（in terge nic regio n, IG区）基因II与基因IV之间存在一段 507bp的基因间隔区，含有复制起始位 点，是实施改造、构建人工载体的重点 区域②IG区只有一个Bsu I切点2）加入酶切位点，在IG区加入单一 切酶位点M13mp1在IG区插入一个大 肠杆菌的LacZ'（-肽序列）使克隆1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（-）链，该 双链称复制型 DNA（ RFDNA2、RFDNA在宿主细胞 能快速增殖，可增加到每个细胞约 200个拷贝3、单链特异的DNA吉合蛋白结合在 （+ ）链上，从而阻 断了其互补链，即（―）链的合成，这样，细胞就 会不断的合成（+）链DNA 4、游离出来的（+）链 DNA先与基因V的编码产物形成特异的 DNA-蛋白质 复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因 V的蛋M13mpn n代表系列数 字② 对M13mp1的改 进加上常用 的酶切位点M13mp2LacZ' 5'端的DNA片段以特定单链的形式输出受体 细胞外，M13重组分子筛选简便， 被M13 噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成 混浊斑，易于辨认挑选。

而且重组分子 越大，混浊斑的混浊度亦越大 但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小， 只有1.5 kb白质从（+） DNA链上脱落下来，余下的 M13（ +）链 DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程 中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的 （M13噬菌体产生单双链DNA的机制）的第13个核 苷酸G突变成 A,产生了一 个EccR I切 占八、、噬 菌 体- 质 粒 杂 合 载 体黏粒载体考斯质粒是一类人工构 建的含有入-DNAcos序 列和质粒复制子的的特 殊类型载体能像 -DNA那样进行体外包 装，并咼效转染受体细 胞；能像质粒那样在受 体细胞中自主复制具有 较咼容量的克隆能力： 45kb ;具有与同源性序 列的质粒进行重组的能 力粘粒（cosmid ）是带有 cos序列的质 粒cos序列是 噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA序列黏粒的组成包括质粒复制起点（colEI ）,抗性标记（amp）, cos 位 点，因而能象质粒一样转化和增殖克 隆的最大DNA片段可达45kb 有的 粘粒载体含有两个 cos位点，在某种程度上可提高使用效率设计构建的柯斯质粒一般长 4〜6kb。

其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白凡具 有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌 体基因组，就可以冋外壳蛋白结合而被包装成类似 噬菌体入的颗粒因此，插入柯斯质粒的外源 DNA可大于40kb重组的柯斯质粒可象噬菌体入一样感 染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制噬菌 粒载 体能像质粒那样在受体细 胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装， 并高效转染受体细胞 装载量比常规的 M13mp系列要大很多（10 kb 通过克隆双链 DNA能获 得同等长度的单一单链DNA噬菌粒载体综合了质粒载体和 M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、 抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体 DNA间隔区（含有噬菌体DNAM制起始、 终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需 的全部顺式作用元件）它具有质粒的复制起点、选择性标记、 多克隆位点等，方便 DNA的操作，可在 细胞稳定存在；又具有单链噬菌体的复1.具有较小分子量基因组 DNA可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个 amP基因作为选择记号， 便于转化子的选择；3.拷 贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区，因此多 种不冋类型的外源 DNA片段，不经修饰便可直接插 入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌 lacZ基因的5'-端编码区，可按照IPTG显色反应 试验师选6. lacZ 基因是置于lac启动子的控制之 下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；PUC118 和PUC119重组操作简便，筛选容 易制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进 行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌 体7含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链 DNA 分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅 助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单 DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 9.;在PUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的 核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一 个可转录克隆基因的正链 DNA另一个则可转录出负链DNA人工染色 体染色体具有复制功能， 利用染色体的复制元件 来驱动外源DNA片段复 制的载体称为人工染色 体载体其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体 和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓 展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。

人工染色体载体拷贝数少，制备困难， 通常采取“穿梭载体”的策略来解决含有质粒载体所必备的第一受体 （大肠杆菌）质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌可以按质粒复 制形式进行高拷贝复制， 含有第二受体（如酵母）端粒（TEL）、DNAM制起始位点（ARS）和着丝粒（CEN） 以及合适的选择标记载体在体外与目的 DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进 行复制和传递筛选第一受体的克隆子一般采用抗 生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与 受体互补的营养缺陷型酵母人工染 色体载体YAC 细菌人工染 色体载体BACP1噬菌体人 工染色体载体PAC质粒载体总结质粒 载 体类型长度选择标记克隆位点PSC101天然质粒，属严紧型、低拷贝型9.09kb四环素抗性Tetr7 个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hi nd III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColEI天然质粒，属松弛型多拷贝型6.3 kb大肠杆菌素（colicin ） E1 和对E1免疫的 基因（immEDEcoR I位于E1部，插入外源 DNA会导致E1失 活，使受体菌不能合成 E1 （ColEI ），但仍然表现出对E1免疫型（ImmEl）pBR322兀件来源①复制起点 oripMB1系列（来源于ColEI ）的高拷贝型复制起点② Ampr 基因pSP2124质粒的Amp基因③Tet r基因pSC101的 Tetr基因。

4363bp氨卞冃霉素和四环素抗性24个克隆位点其中9个会导致 Tetr基因失活（如BamH、Hi nd川、Sal I ）;3个会导致 Amp基因失活（Sca I、PvuI、Pst 1）pUC系列（i ）来自pBR322质粒的复制起点（ori ）; （ii ）氨苄青 霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原来的核酸切限制 酶的单识别位点； （iii ）大肠杆菌 3 -半乳糖酶基因（lacZ ）的启动子及其编码 a -肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ '基因；（iv ）位于lac Z'基因中的靠近 5'-端的一段多克隆位点（MCS区段，但它并不破坏该 基因的功能2.7kbAmpicilli n 抗性和lacZ 的a肽互补（监白斑）相 结合10个连续的单一限制酶切位点，位于 lacZ '基因的5'端TA载体耐热聚合酶可在 PCR产物的3'端加上一个非配对的 脱氧腺嘌呤核苷（A）根据这一特点研制出线性 TA质粒载体，其5'端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧 啶（T），用该载体可进行 PCR产物的直接克隆TA载体构建：在 般质粒载体的基础上构建方法1:先采用限制性切核酸酶酶切使质粒载体线性化， 再通过K1enow片段将酶切的线性载体末端补平方法2:利用产生平末端的限制性切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化钝 末端质粒载体加 T反应形成。

目前有很多公司推出了 TA质粒载体入噬菌体载体入噬菌体载体分类插入式载体一种只具有一 个可供外源DNA 插入的克隆位 点的派生载体入噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于 cDNA文库或基因组文库的构建cl 基因插入失活：如入 gt10、入NM1149等载体，在cl基因上有EcoR I及Hind III 的酶切位点外源基因插入后将导致cI基因的失活cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑相反，产生混浊 的噬菌斑Lac Z 基因插入失活：如 charon16A载体，在非必须区段引入 lac Z 基因，在lac Z 基因上有 EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）置换型载体（取代型载 体）具有成对的克 隆位点，在这 两个位点之间 的入DNA区段可 以被外源DNA 片段所取代野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源 DNA可以取代这一片段这些载体是用Lac 5替换入噬菌体的中间区段，同时将 Lac 5作为选择标记使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、 包装而后，感染E.coli使之在E.coli繁殖，并裂解 E.coli ,形成空斑。

置换型入噬菌体是使用最广泛的载体人工染类别元件优点酵母人工染色体 载体YAC是最常用来克隆 很大DNA片段（2Mb的系统为构建YAC需要结合四个短序列：即二个端粒、」 一个着丝粒和一个 ARS元件，并将一适当大小的 外源DNA连接成一线性DNA分子，而端粒序列位 于正确的末端YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，。