生物标志物实验ppt-PowerPointPresen.pptx

实验实验 四 生物标标志物实验实验水生动动物谷胱甘肽转肽转 移酶活性测测定 指导老师：刘汝涛山东大学环境科学与工程学院 目的与要求 实验原理 设备与材料32 步骤与方法 结果与报告541（1）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活 性影响2）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法12 谷胱甘肽转肽转 移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽转肽转 硫酶）是细细胞质质内催化相反应应起解毒作用的重要酶，具有许许多同工酶污污染物进进入体内经过经过 相反应应后，在谷胱甘肽肽转转移酶的催化下，细细胞内还还原性谷胱甘肽肽能结结合相反应产应产 生的亲电亲电 性中间间体，从而生成亲亲水性的化合物细细胞膜上有多种的跨膜运输输机制（如通过过ATP推动动GS-X泵泵）能使这类亲这类亲 水性的化合物排出细细胞，使之进进入血液循环环并最终终以尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用在很多物种中，谷胱甘肽结肽结 合作用是相反应应的主要形式 GSTs催化的一般反应为应为 ： GSH +R-X = GSR + HX 在该该反应应中，GSTs的主要功能是通过过其活性中心增加GSH和亲电亲电 性底物的接触机会，然后激活GSH上琉基，诱导诱导 其对对底物的发动亲发动亲 核性攻击击从而形成结结合产产物。

2 迄今的研究表明GSTs存在于所有的动动物体内，肝脏脏是脊椎动动物种GSTs分布的主要场场所鼠肝中的GSTs占可溶性肝蛋白的10，而鱼鱼肝中的GSTs也是可溶性肝蛋白的主要成分GSTs能被多种的污污染物所诱导诱导 ，如有机氯农药氯农药 、多环环芳烃烃和多氯联氯联 苯等在哺乳动动物中，经经多环环芳烃处烃处 理后，其肝脏脏中GSTs活性比对对照组组高1.52.0倍在不同的水生动动物体内GSTs可被多环环芳烃诱导烃诱导 ，其活性高于对对照组组2倍野外研究发现发现 ，在同一条河流中，污污染段面鱼鱼体内肝脏组织脏组织 和消化管组织组织 中GSTs含量和活性比清洁洁断面高出34倍然而，研究也发现发现 GSTs活性活性诱导诱导 受环环境条件、生物种类类和化合物性质质的影响，存在较较大的差异 基于上述原因，用GSTs作为为生物标标志物来指示特定的污污染暴露，近年来在生态态毒理学的研究中获获得了广泛的运用在本实验实验 中，将采用体内实验实验 的方法，测测定水生动动物暴露于有机氯农药氯农药 林丹（Lindane）之后，其体内GSTs酶活性的变变化 1器材 冷冻冻离心机（Beckman Coulter 22R centrifuge），酶标仪标仪 （Bio-Tek Instruments，INC）pH计计，溶解氧测测定仪仪，电导电导 率测测定仪仪，96孔板，1.5mL离心管，水浴锅锅，生物冰袋，移液枪枪（20uL、100uL、1000uL）及对应枪头对应枪头 。

2受试试生物 成年雄性的钩虾钩虾 （Gammarus pulex）从野外采集投放在 10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在 15（1），12h光照的条件下至少驯驯养一周，才能进进行染毒暴露驯驯养期间间，用接种了真菌（Cladospurium sp.）发发酵1周的桤桤木叶（Alnus glutinosa L.）喂食3 3试剂试剂 1-氯氯-2，4-二硝基苯（CDNP），还还原性谷胱甘肽肽（GSH），谷胱甘肽转肽转 移酶标标准品（GSTs），苯甲基磺酰酰氟（PMSF），Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚醚），EDTA 4溶液的配制 （1）林丹储储存液 取50mg林丹固体颗颗粒，溶于500mL的丙酮酮中配制成100mg/L的林丹储储存液，于4下阴暗处处密封保存备备用3 （2）酶和缓缓冲液 配置pH=6.5，0.02M磷酸缓缓冲液（PB） 利用此磷酸缓缓冲液配制下面三种实验缓实验缓 冲液： （i）组织组织 破碎缓缓冲液（HB）：含有1.0Triton X-100（v/v）和1.0PMSF（v/v）的磷酸缓缓冲液； （ii）冲洗缓缓冲液（DB）：含有1.0PMSF（v/v）的磷酸缓缓冲液； （iii）空白缓缓冲液（BB）：含有0.1Triton X-100（v/v）和1.0PMSF（v/v）的磷酸缓缓冲液。

100mmol/L PMSF溶液 用95乙醇溶解适量的PMSF，于阴暗处处保存，-20可保存一个月，-4可保存5d3 40mmol/L CDNB溶液 用95乙醇溶解适量的CDNB，保存方法与PMSF相同 20mmol/L GSH标标准液的配制 配制100mmol/L EDTA母液，用0.1mol/L KH2PO4稀释释母液至EDTA的浓浓度为为1mmol/L在1mmol/L的EDTA溶液中加人适量GSH使其终浓终浓 度为为20mmol/L用1mol/L HCl或1mol/L KOH校正pH于阴暗处处保存，-20可保存一个月，-4可保存5d 酶活测测定液 实验实验 之前配制，将CDNB和GSH溶液从冰箱中取出，置于室温取5份的20mmol/L GSH标标准液、9份的磷酸缓缓冲液（pH=6.5，0.02mol/L）和1份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活测测定液3 1暴露试验试验 按照急性毒性试验试验 方法，将雄性的成年钩虾钩虾 分别别暴露于梯度林丹浓浓度中暴露温度设设定在151，光暗比为为12h12h实验实验 开始时测时测 定各浓浓度梯度林丹曝气水的溶解氧，pH和电导电导 率。

暴露48h后，将存活的个体从容器中打捞捞出来，先用吸水纸纸将表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚乙烯烯离心管中（每管一只）将这这些离心管的放入液氮罐20s以猝死钩虾钩虾 取出的离心管在-70保存4 2酶活力的测测定 将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL的冷的组织组织 破碎缓缓冲液（pH=6.5）捣捣碎研磨管内的钩虾钩虾 2030min，加入9uL冷的冲洗缓缓冲液DB（pH=6.5）4下14000g离心3min，取100uL的上清将此上清移另一置于生物冰袋上的离心管中往新的离心管内加入900uL空白缓缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用 在一个干净净的1.5mL的离心管内加入500uL酶活为为 1.4单单位/mL的谷胱甘肽转肽转 移酶标标准样样品，加入500uL的冷的空白缓缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀4 在96孔板中加入50uL的GST标标准样样品，钩虾组织钩虾组织 液上清或者空白缓缓冲液（BB），每组设组设 四个平行然后加入150uL酶活测测定液，使每个孔内含有200uL的反应应液将96孔板放入酶表仪仪30轻轻微震荡荡反应应30min，然后充分震荡荡96孔板以混合各反应应液。

340nm下每隔1min记录记录 一个吸光值值，计计算吸光值值随时间时间 的变变化的斜率 式中：OD为为吸光值值随时间变时间变 化的斜率（OD340/min）；为为摩尔吸光系数（9600mol-1cm-1）；R为为反应应系统统体积积（uL）；S为样为样 品上清的体积积（uL）；W为样为样 品蛋白浓浓度（g/L）； P为样为样 品厚度（0.6cm）4GST酶活 3总总蛋白的测测定 以牛血清蛋白为为校正标标准，用Bio-Rad公司的试剂试剂 盒检测检测 定钩虾组织钩虾组织 破碎液中的蛋白质浓质浓 度将牛血清蛋白溶于磷酸缓缓冲液（pH=6.5）中，配制成200mg/L的蛋白标标准液取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和1.35mL该该蛋白标标准液，先加入8mL磷酸缓缓冲液（pH=6.5），再加入空白缓缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓浓度依次为为0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和25.0mL的蛋白标标准液系列从每个浓浓度的蛋白标标准液中取出800uL至干净净的EP管中，加入200uL Bio-Rad产产品稀释缓释缓 冲液取80uL的虾组织虾组织 液上清至一个干净净的EP管中，加入80uL的 0.1的Triton X-100，用640uL磷酸缓缓冲液（pH=6.5）稀释释混合液至800uL，加人200uL Bio-Rad产产品。

4 从上述的反应应体系中取出200uL和Bio-Rad反应过应过的蛋白液（钩虾组织钩虾组织 破碎液上清，牛血清蛋白），每组设组设 三个平行，加入96孔板内25下，摇动摇动 96孔板20s后，用酶标仪测标仪测 定620nm下的吸光度根据牛血清蛋白标标准液的读读数汇汇出标标准曲线线，计计算出曲线线的斜率K 式中：OD620为为待测样测样 品620nm下的吸光度；K为为牛血清蛋白标标准样样曲线线的斜率4蛋白浓浓度51.急性毒性试验结试验结 果记录记录曝气水空白溶剂组对照林丹1ug/L林丹3ug/L林丹6ug/L林丹12ug/L林丹24ug/L各实验组参数 溶解氧（mg/L）pH电导率（ms）钩虾死亡个体数(只) 0（h） 24（h） 48（h）52酶活力与蛋白活力的测测定试验结试验结 果记录记录曝气水空白溶剂组对照林丹1 ug/L林丹3 ug/L林丹6 ug/L林丹12ug/L林丹24 ug/L酶活测定OD340(min)蛋白测定OD620酶活(molLg-1min-1)。