RNA干扰技术和应用.docx

RNA干扰技术和应用RNA干扰技术和应用 RNA干扰技术和应用RNA干扰技术简介 RNA干扰技术简介RNA干扰 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是正常生物体内抑制特定 干扰(RNA interference,RNAi)是正常生物体内抑制特定 基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA mRNA编 基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编 码区同源的双链RNA(double RNA,dsRNA)时 码区同源的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)时，该 mRNA发生降解而导致基因表达缄默的现象 发生降解而导致基因表达缄默的现象， mRNA发生降解而导致基因表达缄默的现象，这种现象发生在 转录后水平，又称为转录后基因缄默(post (post转录后水平，又称为转录后基因缄默(post-transcriptional silencing,PTGS) gene silencing,PTGS) 外源dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰RNA RNA( 外源dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰RNA(small siRNA) interfering RNA, siRNA)的反义链和多种核酸酶形成了沉 默复合物(RNA (RNAcomplex,RISC),RISC具 默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),RISC具 有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。

RNAi具有特 mRNA的作用而介导RNA干扰的过程 有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程RNAi具有特 异性和高效性这种技术已经成为探究基因功能的重要工具， 探究基因功能的重要工具 异性和高效性这种技术已经成为探究基因功能的重要工具， 并将在病毒性疾病、 并将在病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤的治疗方面发挥重 要作用 要作用RNAi 广泛存在于自然界 11015年美国康奈尔大学SU GUO博士在探究秀丽 11015年美国康奈尔大学 GUO博士在探究秀丽 年美国康奈尔大学SU 新小杆线虫时发觉的 随后，RNAi现象被广泛地发觉于真菌 现象被广泛地发觉于真菌、 随后，RNAi现象被广泛地发觉于真菌、拟南 水螅、涡虫、锥虫、 芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼和哺乳动物等 大多数真核生物中 大多数真核生物中 这种存在提醒了RNAi很可能是出现于生命进 这种存在提醒了RNAi很可能是出现于生命进 化的早期阶段 化的早期阶段 随着探究的不断深化，RNAi的机制正在被逐 随着探究的不断深化，RNAi的机制正在被逐 步说明，而同时作为功能基因组探究 功能基因组探究领域中的 步说明，而同时作为功能基因组探究领域中的 有力工具，RNAi也越来越为人们所重视 也越来越为人们所重视。

有力工具，RNAi也越来越为人们所重视 RNAi 探究的一般技术路途– 专业设计的 RNAi 靶点 – 最正确的siRNA介导载体(化学合成siRNA,载 最正确的siRNA介导载体(化学合成siRNA,载 体介导的shRNA,病毒介导的shRNA) 体介导的shRNA,病毒介导的shRNA) – 有效导入细胞的手段 – mRNA knockdown的检测 knockdown的检测 – 美丽的功能学和表型学分析RNA干扰 RNA干扰何为siRNAs 何为siRNAs 越来越多的探究人员起先采纳小分子干扰RNA 越来越多的探究人员起先采纳小分子干扰RNA ( small interfering RNAs , siRNAs ) 来抑 RNAs, siRNAs) 制特定的哺乳动物基因表达 制特定的哺乳动物基因表达 siRNA即为能够以同源互补序列的 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶 即为能够以同源互补序列的mRNA为靶 目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断 目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断 双链RNA分子 分子 双链RNA分子 如何设计有效的siRNA 始终是当前 始终是当前RNAi 探究 如何设计有效的 siRNA始终是当前 RNAi探究 的热点话题，不同的试验室有不同的结果。

的热点话题，不同的试验室有不同的结果 化学合成siRNA 化学合成siRNA很多国外公司都可以依据用户要求供应高质量的化学 合成siRNA主要的缺点包括价格高，定制周期长， 合成siRNA主要的缺点包括价格高，定制周期长， 特殊是有特别需求的由于价格比其他方法高， 特殊是有特别需求的由于价格比其他方法高，为一 个基因合成3 的本钱就更高了， 个基因合成3—4对siRNAs 的本钱就更高了，比拟常 见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进展化 学合成 学合成 最适用于：已经找到最有效的siRNA的状况下 的状况下， 最适用于：已经找到最有效的siRNA的状况下，须要 大量siRNA进展探究 大量siRNA进展探究 不适用于：筛选siRNA等长时间的探究 等长时间的探究， 不适用于：筛选siRNA等长时间的探究，主要缘由是 价格因素化学合成的 siRNA 特点： 特点：– – – – – – – – 突出端为dN碱基，增加siRNA对 突出端为dN碱基，增加siRNA对RNAse 降解的耐受性 碱基 操作简洁 试验时间短 结果明确 试验重复性高 可以依据须要设计多种嵌和体 适合于： 适合于：靶点筛选 已经找到最有效的siRNA的状况下 须要大量siRNA进 的状况下， 已经找到最有效的siRNA的状况下，须要大量siRNA进 行探究 不适用于：筛选siRNA等长时间的探究 等长时间的探究， 不适用于：筛选siRNA等长时间的探究，主要缘由是价 格因素 体外转录siRNA 体外转录siRNA 以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs,本钱 Oligo为模版 通过体外转录合成siRNAs, 为模版，相对化学合成法而言比拟低，而且能够比化学合成法更快 相对化学合成法而言比拟低， 的得到siRNAs。

缺乏之处是试验的规模受到限制， 的得到siRNAs缺乏之处是试验的规模受到限制，虽然 一次体外转录合成能供应足够做数百次转染的siRNAs, 一次体外转录合成能供应足够做数百次转染的siRNAs, 但是反响规模和量始终有必须的限制 但是反响规模和量始终有必须的限制而且和化学合成相 还是须要占用探究人员相当的时间 比，还是须要占用探究人员相当的时间值得一提的是体 外转录得到的siRNAs毒性小 稳定性好，效率高， 毒性小， 外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需 要化学合成的siRNA量的 量的1/10就可以到达化学合成 要化学合成的siRNA量的1/10就可以到达化学合成 siRNA所能到达的效果 从而使转染效率更高 siRNA所能到达的效果，从而使转染效率更高 所能到达的效果， 最适用于：筛选siRNAs,特殊是须要制备多种siRNAs, 最适用于：筛选siRNAs,特殊是须要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时 化学合成的价格成为障碍时 不适用于：试验须要大量的，一个特定的siRNA长期研 不适用于：试验须要大量的，一个特定的siRNA siRNA表达载体的优点在于可以进展较长期研 siRNA表达载体的优点在于可以进展较长期探究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续 ——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续 抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。

抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久 病毒载体也可用于siRNA表达 表达， 病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以 干脆高效率感染细胞进展基因缄默的探究， 干脆高效率感染细胞进展基因缄默的探究，幸免 由于质粒转染效率低而带来的种种不便, 由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染 效果更加稳定 效果更加稳定 siRNA表达载体 siRNA表达载体 最适用于：确定一个有效的siRNA序列，须要维 最适用于：确定一个有效的siRNA序列 序列，持较长时间的基因缄默 持较长时间的基因缄默 不适用于：筛选siRNA序列(其实主要是指须要 不适用于：筛选siRNA序列 序列(多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作) 多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作) siRNA表达载体 siRNA表达载体多数的siRNA表达载体依靠 多数的siRNA表达载体依靠3种RNA聚合酶III 启动子(pol III) 表达载体依靠3 RNA聚合酶 聚合酶III 启动子(pol 中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达 在哺乳动物细胞中的表达 中的一种 ， 操纵一段小的发夹 siRNA在哺乳动物细胞中的表达。

包括的人源和鼠源的U 启动子和人H 启动子 包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子 之所以采纳RNA III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中 之所以采纳RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中 表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串( 表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串(3到6个)U 来终止转录的 来终止转录的 运用这类载体，须要2段编码短发夹RNA序列的 序列的DNA单链 单链， 运用这类载体 ， 须要 2段编码短发夹 RNA序列的DNA单链， 退 克隆到相应载体的pol 启动子下游 火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游 由于涉及到克隆， 由于涉及到克隆，这个过程需 要几天的时间， 要几天的时间，同时也须要经 过测序以保证克隆的序列是正 确的 不过载体简单大量扩增， 不过载体简单大量扩增，这个 优点足以弥补全部缺陷， 优点足以弥补全部缺陷，特殊 是当载体在试验中的确有效的 时候不同载体适合不同探究须要 瞬时表达载体 适合于较长时间基因抑制作用的探究，不同抗性和不同 适合于较长时间基因抑制作用的探究， 报告基因，可实现不同基因在同一细胞的协同抑制探究； 报告基因，可实现不同基因在同一细胞的协同抑制探究； 可诱导载体 利用四黄素类似物开关对目的基因的抑制； 利用四黄素类似物开关对目的基因的抑制； 腺病毒载体 适合于在不同细胞类型中探究同一基因RNAi结果 适合于在不同细胞类型中探究同一基因RNAi结果 反转录病毒载体 供应一种可整合的， 供应一种可整合的，稳定的基因抑制探究手段 慢病毒载体 供应一种可整合的，并且可以感染分裂和非分裂细胞， 供应一种可整合的，并且可以感染分裂和非分裂细胞， 稳定的基因抑制探究手段。

稳定的基因抑制探究手段本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第7页 共7页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页第 7 页 共 7 页。