紫杉醇发酵生产工艺.docx

微生物发酵生产紫杉醇 产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜 类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的 抗癌药物之一⋯紫杉醇最早是wanj等于 1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia) 树皮中分离得到的随后，schiff等证实 紫杉醇具有独特的抗癌机制随着紫杉醇 的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主 要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管 (Microtllbules)合成，以 阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖 (IPS)的作用，可调节机体的免疫功能目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取 及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道紫杉醇的工业生 产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇 需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红 豆杉细胞培养及微生物发酵微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越 来越受到国内外研究学者的广泛关注 这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉 醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵 罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。

创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至 大肠杆菌，让其表达，此过程刚被Parayil Kumaran Ajikumar及其同事实现，而运用代谢工程 手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的国内外研究： 1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产 生紫杉醇，定名为安德列亚霉此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作， 陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉 醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种周东坡领导的课题组从百年以上 的东北 红豆杉的枝条与树皮中分离到3株可产紫杉醇的内生真菌，发酵液中紫杉醇的产量可达 51．06μg/L～125．70μg／L王建锋等也从南方红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢菌，发 酵产物分析表明可产紫杉醇，产量为185．4μg/L 2、菌种改良： 诱变：HQD33（周东坡分离）经过紫外线、EMS、60co、NTG等诱变剂顺序诱变得到高产突变 株NCEU一1，其紫杉醇产量到达314．07μg/L。

原生质体融合：赵凯等人发现最佳的诱变条件 为30w紫外灯、30cm距离、照射50s；UV+Licl复 合诱变、照射时间40s 3、构建工程菌：紫杉醇的生物合成途径为最近Parayil Kumaran Ajikumar 及其同事通过平衡数种细菌和植物的酶来利用大肠杆菌发 酵产物紫杉二烯，其产量为 1g/L. 工艺流程：一、产紫杉二烯工程菌构建：基因文库的构建：取欧洲紫杉醇提取染色体 目标基因的获得：取得合成紫杉二烯酶的结构基因及调控系列 扩增质粒的构建：将紫杉二烯酶的结构基因及调控系列连接到质粒上二、大肠杆菌发酵生产紫杉二烯：培养基原料 培养基配制 培养基灭菌工程菌 摇瓶 种子罐 生产罐 培养液 细胞分离三、通过基因工程手段调整高产紫杉醇酵母产紫杉醇的途径，使它能利用紫杉二烯高效合 成紫杉醇，构建工程菌 四、酵母发酵生产紫杉醇培养基原料 培养基配制 工程菌 摇瓶 种子罐 生产罐 培养液 细胞分离无细胞上清液 产品抽提产品精制产品包装废水处理 培养基原料：大肠杆菌发酵液质量标准 主要活性成分：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮- 4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13－[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。

按干燥品 计算，含 C47H51NO14 应为 98.0－102.0% 性状：白色结晶性粉末，无臭，无味在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水重组 DNA 导入宿主细胞工程菌的培养与目标产物分离表达质粒的构建与诱导表达扩增质粒的构建基因文库的构建目的基因的获得载体质粒的制备中几乎不溶比旋度 取本品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每 1ml 中含 3mg 的 溶液，依法测定，比旋度为-48°至-56° 鉴别：（1）取与紫杉醇对照品，分别加甲醇制成每 1ml 中的含 1.0mg 的溶液，照薄层色 谱法（试验，吸取上述两种溶液各 10μl，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以正己烷-醋酸 乙酯-氯仿-甲醇-三乙胺（4∶3∶2∶1∶1）为展开剂，展开后，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶 液，在 105℃加热 10 分钟后检视，显紫黑色斑点，供试品溶液所显主斑点的颜色和位置应 与对照品溶液的主斑点相同 （2）在含量测定项下所记录的色谱图中，供试品溶液主成分峰的保留时间应与对照品溶液 主成分峰的保留时间一致 （3）红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致经济效益：产量为 2mg/L 建十只十立方米的发酵罐产值 2*10*10*365/1000*400000=2920000$各种杂费为 1460000$[3]利润：1460000$参考文献：[1]Isoprenoid Pathway Optimization for Taxol Precursor Overproduction in Escherichia coli[2]Isolation and characterization of endophytic taxol-producing fungi from Taxus chinensis[3]A review: recent advances and future prospects of taxol-producing endophytic fungi [4]微生物发酵生产紫杉醇研究进展 [5]Taxol biosynthesis。