免疫荧光通用操作规程.docx

免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4°C过夜 后，OCT包埋20C保存3月，-80C长期保存请勿保存于液氮2, 冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20C储存 3，切片从-20 取出后，在通风橱放 10-30 分钟以去除水汽， 4%PFA固定15分钟，或-20C丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS 清洗玻片， 3X5min 从此请保持玻片湿润 5，有时，抗原修复3 小时会得到更好的结果为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）… 关注修复的温度 ，时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的 时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液… 选择不同 PH 值的修复液（ A 液 枸盐酸缓冲液 PH6.0， B 液EDTA-Na缓冲液PH8.0， C液 枸盐酸缓冲液PH4.5）6，室温封闭 1 小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in lxPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS （细 胞因子，无需封闭的蛋白7, 一抗4°C过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyelight ）in 封闭液，避光室温 1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核 5min，12， DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存石蜡切片的免疫荧光1, 动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤）,制成石蜡 包块2, 组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um, 切片复水： 58C20min-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min- 70%EtoH10min-, DDW5min4, Rinse 玻片 1xPBS, 从此请保持玻片湿润 5，抗原修复过夜。

为此请： 选用稳定的抗原修复方式 （真空负压 . 微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度,时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须 遵循自然降温规律,使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复 液（ A 液 枸盐酸缓冲液 PH6.0， B 液 EDTA-Na 缓冲液 PH8.0， C 液 枸盐酸缓冲液 PH4.5）6，室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in lxPBS条件封闭液：l%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in lxPBS （细 胞因子，无需封闭的蛋白7, —抗4°C过夜请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞 因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （Dyelight ）in 封闭液，避光室 温 1 小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DDW Rinse ,DAPI 染核 5min，12，DDW Rinse 13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14,干片后4C保存备注： 多重荧光染色原则A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染B：如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，抗原修复: O/N第一个一抗：4°C 0/N ,第二天对应二抗@只丁 lhr红光短暂地封闭第二个一抗：@RT 2hr,对应二抗@只丁 lhr绿光DAPI封片备注： 对照实验A:阴性对照：组织免疫荧光必做相同标本：只加荧光二抗:排除非特异性染色不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性B：阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本TUNEL 与免疫荧光共染时细胞的免疫荧光1，细胞生长贴壁到 80%融合，倒掉细胞培养液2, Rinse,用固定剂rinse 一到两次3, 首选 4%多聚甲醛固定 15min , 0.2%TritonX-100 打孔 5-10min；或者选用不同的固定方式：甲醇（分析纯 or HPLC）-20C l0min丙酮（HPLC） -20 C 10min4%多聚甲醛+0.2%TritonX-100 10min4%多聚甲醛+0.2%Saponinsl0min细胞核核膜4%多聚甲醛15min +-20°C甲醇5min细胞膜4%多聚甲醛15min + -20C丙酮5min细胞骨架/微管蛋白4%多聚甲醛lOmin @RT+4 C 10min+ -20C甲醇lmin细胞膜+胞浆蛋白+ 细胞核4, Wash,1xPBS,2x1min 从此请保持细胞湿润5, 室温封闭1 小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in lxPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS6, 一抗4C过夜请用封闭液稀释一抗7, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min8, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （Dyelight ）in 封闭液，避光室温 1 小时9, Wash,1XPBS, 3x5min, DDW Rinse10, DAPI 染核 5min，11， DDW Rinse12，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜13,干片后4C保存。