植物条形码研究.doc

1植物条形码研究中的候选片段在植物+DNA条形码的研究进展相对缓慢，主要冇两方而原因：(1)植物线 粒体基因组进化速率较慢，遗传分化小，因此动物中的标准片段COI不适用于植 物；(2)系统学研究中常用的片段变异较小，不适合用作条形码片段(Chase et al, 2005； Kress et al. , 2005)由于核基因组通常具有多拷贝的特性，且物 种内变异较大，引物通用性差，并且扩增时对模板DNA的质量要求高，不适用于 存在DNA降解的材料(Kress et al, 2005),因此,植物中最可能的条形码还是 从叶绿体基因组中选择(Chase et al. , 2005； Cowan et al, 2006)虽然叶绿 体基因相对保守，但仍然包含许多变异区域，同时叶绿体基因组冇英自身的优势; 单亲遗传避免了基因重组；植物个体中均有大量的叶绿体，即使DNA高度降解也 容易扩增生物条形码联盟(CBOL)最初建议的植物条形码片段均为叶绿体片段：matK, rpoCl, rpoB, accD, nhdj所YCF5但因为后• 3个片段在一些主要的植物类群中 有缺失，如YCF5在苔辭类植物中缺失，accD,在禾木科植物中缺失，而ndhj 松属植物中缺失，在部分兰花中变短或功能丧失，因此它们在第二阶段的更新中 已被排除(http： //www. kew. org/barcoding/) o此外，一些研究者也建议了其他 的片段。

例如:Kress等(2005)建议ITS和trnll-psbA两个片段，Chase等(200 5)和Newmaster等(2006)建议rbcLo更多的信息可以通过以下几个网站查询：w wav. barcodi ng. si. edu> wfgv. barcodeoflife .o rg> http： //phe .rockefeller .e du/BarcodeConference/> http： //www. kew. org/barco-ding/0由于越来越多的研究表明单-靠某-个片段不太可能对所有的植物物种进行 准确鉴定，研究者又相继提击了不同的片段组合方案片段组合的观点最早在K ress等(2005)的文中冇所提及，他们预测TTS+trnH-psbA将是被子植物中具冇 广泛应用价值的组合，但并未做分析2007年Chase等明确提出两套组合方案: rpoCl+rpoB+marK 和 rpoCl+matK+trnH-psbAo 同年 Kress 和 Erickson (2007)又 提出使用rbcL+trnH-psbA对陆生植物进行识别和鉴定2007年9月在台北举行 的第二届国际生物条形码大会上韩国植物学家Ki-Joong Kim等提出matK+atpF- atpH+psbK-psbl 和 mark+atpF-atpH+trnH-psbA 两个组合(Pennisi, 2007； www. dnabarcodes2007. org)。

以上5种被提议的植物条形码组合方案构成了当前广泛 讨论和评价的内容在这些叶绿体片段中,rpoB, rpoC, rbcL> malK是编码区 片段，trnll-psbA, atpF-atpH 和 psbK-psbl 是非编码区片段2各条形码片段和组合方案的应用现状究竟哪些片段或组合在植物条形码研究中具有更好的应用前景？目前还没有 一致意见对片段的选择和评价应该考虑以下几个方而：(1)引物的通用性；(2) 物种内部的变异程度；(3)区分物种的能力；(4)生物信息学的分析和应用(Kres s& Erickson, 2008) 0以此为标准，以下就每个片段及组合分别进行介绍 2.1单片段情况2. 1. 1 matK相对于其他编码区片段，matK片段进化速率快，但不同分支类群间很难进 行扩增和测序，因此其作为条形码最主耍的争议是引物通用性差(Chase et al., 2007； Hollingsworth, 2008),不同类群往往需要釆用不同的引物使用生物条 形码联盟植物工作组(Plant Working Group of the Consortium for the Bare ode of Life, PWG-CBOL)建议的matK引物,Sass等(2007)未能在苏铁目中得到 理想的扩增效果；Kress和Erickson (2007)对48属96个物种检测的扩增成功率 仅为39. 3%； Ncwmastcr等(2008)在肉豆蔻科内毛楠(Compsoncura) 8个物种中 的扩增同样失败。

即使使用了 10对该片段的不同引物,Fazekas等(2008)在32 属92种251个个体中仅获得87. 6%的扩增成功率近些年，该工作组和Ki-Joo ng Kim投入了相当多的工作开发该片段的通用引物，但至今未取得理想的结果 (Fazekas et al. , 2008) o这一片段已有的部分引物序列见表1 (略)与上述结果截然不同的是，Lahaye等(2008b)采用marK的390F/1326R引物 俵1略)在所研究的1667个植物材料中得到100%的扩增率，并且单独使用mat K或与trnll-psbA组合使用都可以止确识别90%以上物种最近，Lahaye等(200 8a)又再次强调matK可以作为单个片段应用于植物条形码，而对于疑难类群再针 对性地增加片段但是，该实验设计本身存在一些问题，结论也有待商榷，例如: 他们所分析的材料96%是兰科植物，不能说明其他科的情况(Kress & Erickson, 2008)；有些物种缺乏重复个体，而且没有包含同属内关系最近的姊妹种(Holli ngsworth, 2008),如果材料是姊妹种,识别率可能会降低(Lahaye et al. , 20 08b) o最近，Fazekas等(2008)采用Lahaye等介绍的390F/1326R引物获得的扩 増成功率低于50%。

我们使用该对引物在不同科、属间的扩増效果也不理想(待 发表)因此matK的引物通用性和鉴定效果还冇待更多的实验数据检验，开发广 泛适用于植物各类群的通用引物是meitK的一个工作重点2. 1. 2 trnH-psbAtrnH-psbA片段是进化速率最快的叶绿体间隔区之一，片段两端存在75bp 的保守序列，便于设计通用引物(Shaw et al., 2005)该片段引物(表1略)通 用性较好,扩增成功率较高(Kress et al. , 2005； Kress& Erickson, 2007； F azekas et al., 2008； Lahaye et al. , 2008a, b； Newmaster et al., 2008), 并且平均长度较短(大多数在450bp左右)，冇利于对降解材料的扩(Shaw et al. , 2005) o但该片段中普遍存在插入/缺失事件，甚至在近缘种间也存在(Aid rich et al. , 1988),从而导致了不同植物间片段长度变异较大在Kress等(2 005)分析的53科80属99种植物中,trnH-psbA扩增长度为247-1221bp，间隔 区(排除了引物结合区和外显子侧翼区)为119-1094bp,其中92%的物种扩增所得 的片段长度为340-660bp,而且均具有独特的间隔区序列，符合理想的条形码标 准。

Kress 和 Erickson (2007)采用 9 个候选片段(rpoB> rpoCl> matK^ trnH-p sbA、rbcL、ITS、accD> nhdj 和 YCF5)比较分析了 39 目 43 科 48 属的 96 个种(包 括海藻、苔蘇和地钱类、蕨类、裸子植物和被子植物),Fazekas等(2008)采用 另外 9 个相似的片段(rpoB> rpoCl > matK、trnH-psbA, rbcL> TTS1 > UPA> atp F-atpII和psbK-psbl)对32属92种251个植物个体进行了分析，结果均表明所 冇片段中trnH-psbA在扩增成功率和物种识别率方而表现是最好的区分近缘或近期分化的物种是任何DNA条形码而临的一个挑战(Newmaster et al., 2008)肉豆蔻科是被子植物中一个古老的类群，但乂包含了一些近期 分化的物种在Newmaster等(2008)对该科内毛楠属开展的研究中，只有trnH- psbA可以在每个种产生特异片段，并能成功识别70%的种Lahaye等(2008b)使 用该片段对兰科植物进行鉴定，识别率达90%以上这些结果说明frnH-psbA对 近缘种也有较好的识别。

不过在某些类群中，如伞形科独活Sdleraclcum)和禾 本科甜茅屈(Glyceria), trnH-psbA却不能捉供足够的变异以识别物种(Whipple et al., 2007； Logacheva et al. , 2008)目前使用trnH-psbA最大的困难是非同属物种间的比对，主要是由插入/缺 失过多所引起(Kress et al. , 2005； Lahaye et al. , 2008b)然而，比对容易 与否并不是条形码必需的条件，一旦建立恰当的条形码数据分析方法，插入/缺 失还将会增加物种识别所需要的信息(Kress et al., 2005)在现阶段研究中， 比对可以先在同屈种间进行，Z后再对所冇物种进行比对，并月•尽量增加插入/ 缺失以保证同属种的同源性(Lahaye et al, 2008a)比较已有的多数研究结果, 我们认为trnH-psbA是非常有用的条形码片段之一，即便不能单独使用，也将可 以成为组合方案中的一部分2. 1. 3 rbcL由于在GenBank中有大量的rbcL序列数据，并且其貝有通用、易扩增、易 比对的特点，rbcL被捉议作为条形码片段。

但是rbcL的变异主要存在于种以上 水平,物种水平上通常变异不够大(Kress & Erickson, 2007； Sass et al. , 2 007； Fazekas et al. , 2008； Lahaye et al. , 2008b； Newmaster et al. , 20 08) o通过使用距离法对GenBank中大约10300条长度大于lOOObp的rbcL序列 进行比较分析，Newmaster等(2006)发现尽管rbcL不能识别全部物种，但可以 区分不少同属植物因此，几位研究者都曾建议将rbcL与另外一个或多个片段 组合使用此外，rbcL的整体长度较长(至少1300bp),需要使用4个引物并进 行双向测序才能完成整个基因的测序(Kress et al. , 2005),但理想的条形码要 求片段长度较短，因此有些研究仅选取其中一段进行扩增，如rbcL-a(Kress & Erickson, 2007)虽然该片段的引物通用性相对较好，但也并不是对所冇植物 类群都适用我们采用Kress和Erickson(2007)介绍的rbcL-a引物扩增后发现, 不同科、属间的扩增成功率存在很大差异(待发表)。

2.1.4 nrlTS核基因组的核糖体DMA ITS片段广泛分布于可进行光合作用的真核生物(除 蕨类植物外)和真菌中，是系统学研究中最常用的片段之一，在GenBank中也积 累了大量数据Kress等(2005)最早将其视为植物条形码候选片段组成该片段 的不同部分(ITS1、ITS2和5. 8S)序列变异差别较大,5.8S最为保守，ITS1的识 别效果好于 ITS2 (Chase et al. , 2005)Kress 和 Erickson (2007)的研究中，I TS1在成功扩增的材料中可以达到81. 5%的止确识别率，但该片段的扩增成功率 仅为60. 4%,分析所有研究材料时止确识别率就下降为45. 8%o因此扩增成功率 是ITS作为条。