叶绿体的分离与荧光观察.ppt

实验二 叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的：一、实验目的：1 ．了解叶绿体等细胞器分离的一般原理和方法．了解叶绿体等细胞器分离的一般原理和方法2．． 熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光发荧光和间接荧光1二、原理二、原理•差速离心是分离细胞器的一般方法通过差速离心是分离细胞器的一般方法通过离心力和时间的增加，可将不同的组分分离心力和时间的增加，可将不同的组分分批次沉降，从而分离出各种亚细胞组分批次沉降，从而分离出各种亚细胞组分•叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换利用低速离心机能发生特有的能量转换利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（（0.35mol/L氯化钠或氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤起叶绿体的损伤2•某些物质在一定短波长的光（如紫外光）某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。

有些生物体内的物质受激发光照称为荧光有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光有的生物材料本身如叶绿素的火红色荧光有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光啶橙后可发橘红色荧光3三、材料和试剂三、材料和试剂1．． 新鲜菠菜新鲜菠菜2．． 0.35mol/L NaCl、、0.01%吖啶橙吖啶橙4四、操作步骤四、操作步骤1．． 将新鲜菠菜叶洗净擦干后，加入少量将新鲜菠菜叶洗净擦干后，加入少量0.35 mol/L NaCl匀浆，并悬浮于匀浆，并悬浮于0.35 mol/L NaCl中；中；每组每组4-5g叶片，共叶片，共30ml生理盐水生理盐水2．．4-6层纱布过滤，滤液层纱布过滤，滤液1000rpm离心离心2min，去除，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，取上清液再在后，取上清液再在3000 rpm离心离心5min，即可获，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）；得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）；53．弃去上清液，用约．弃去上清液，用约0.5-1ml 0.35mol/L NaCl悬浮沉淀。

悬浮沉淀在室温下进行分离要迅速在室温下进行分离要迅速4．观察：取悬液直接滴片观察；．观察：取悬液直接滴片观察；5．叶片斜向切面（或手斯叶面下表皮）观察；．叶片斜向切面（或手斯叶面下表皮）观察；6．再分别用吖啶橙染色观察．再分别用吖啶橙染色观察6五、结果和讨论五、结果和讨论1．． 叶绿体自发荧光和激发的次生荧光在显叶绿体自发荧光和激发的次生荧光在显微镜下有何不同？微镜下有何不同？2．． 匀浆时间与叶绿体悬液的浓度有何关系匀浆时间与叶绿体悬液的浓度有何关系？分离叶绿体的操作过程中应注意什么？？分离叶绿体的操作过程中应注意什么？7。