蛋白质的定量测定实验报告.doc

实验名称(Title ofExperimetn)蛋白质的定量测定(Folin -酚试剂法)实验日期(Date ofExperiment)XXXX实验地点(Lab No.)XXXX合作者(Partner)XXXX指导老师(Instructor)XXXX总分仃 otal Score)教师签名(Signature)批改日期(Date)、实验预习1.0实验目的初步了解各种蛋白质含量测定的常用方法掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及熟悉和掌握实验操作技术掌握用excel制作标准曲线和通过标准曲线及标准管方法求样品溶液中待测定物 质含量1.1实验原理1.1.1总体概述Folin-酚试剂法是经过科学家改进的测定蛋白质含量的方法， Folin首创这种方法：利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基(酚基)还原酚试剂(磷钨酸 -磷钼酸)起蓝色反应而后，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂 反应，提高了灵敏度，灵敏度的范围为： 20^250 g,故使得实验的精确度大大提高，但同时也存在着干扰物质多、费时、操作严格计时等问题1.1.2双缩脲反应2在碱性溶液中，双缩脲(H2NOC NH CONH 2)能和Cu作用，发生配位 反应，形成紫色或紫红色的络合物，即为双缩脲反应。

由于蛋白质的肽键结构与双缩脲结构相似，故在碱性溶液中，蛋白质的分子中2 2肽键能和碱性铜试剂中的Cu作用，生成紫红色的蛋白质-Cu复合物对于蛋白质的 测定来说，这一步是基础，这也是 Folin-酚法的基础原理酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐 -磷钨酸盐易背酚类化合物_ 2还原而呈现蓝色酪氨酸（Tyr）含有酚羟基，故蛋白质- Cu复合物含有的酪氨酸或色 氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质的浓度呈线性关系故可以利用上 述两种反应通过分光光度法测定待测样品的蛋白质含量分光光度法测定样品的蛋白质的含量本实验以上述两个反应原理为基础，再通过设置空白对照组，标准管中设置蛋白标准液的一系列浓度梯度（0.2mL, 0.4mL，0.6mL，0.8mL）通过分光光度计测定 吸光度，从而获取标准曲线，样品管通过测定的吸光度值，在标准曲线中找到较为准确 对应的含量1.2实验材料实验样品① 血清稀释液（正常人血清稀释300倍）实验试剂① 200 g/ml牛血清白蛋白标准液（BSA）；② 碱性硫酸铜溶液 （组成：碱溶液与硫酸铜溶液按50:1混合而成，使用时该溶液必须新鲜配制，当日有效）；③Folin-酚试剂（配制过程较为复杂）注：此次实验所用的试剂全部已由老师制备好，所以无配制过程，但需知道配制流程，可查阅实验书P105o实验仪器及器材① V-1100可见光分光光度计;② 恒温水浴箱；③ 试管6支、试管架；④ 加样枪、加样枪架。

1.3实验步骤实验流程132实验步骤步骤操作取6只洁净的试管，利用加样枪按要求量取相应量的溶液，混合均匀（各试管的需加入的试剂和量见下表）：试剂空白管标准管样品管（1）反应体系设置123456牛血清蛋白质标准液00.20.40.60.80样品液000000.5蒸馏水1.00.80.60.40.20.5每隔一分钟，依次往1号试管到6号试管中加入2mL的碱性（2）双缩脲反应硫酸铜溶液，摇匀并记录每支试管的加入硫酸铜时间， 室温静置10mi n(3) Folin-酚反应① 将静置时间达到10min中的试管中，加入0.20mL的Folin-酚试剂，快速摇匀(一般在2s以内)② 在40 C下水浴加热10min钟同样需计时③ 10min钟后取出冷却至室温4)比色测定① 转动波长旋钮，调制500.0nm,按“ mode键切换到T档， 分别将1-6号试管中混合液放入比色杯中利用1号试管为空 白，校置100；② 调至A档，依次测定2-6试管的吸光度，并读取数据③ 重复操作，再读取数据2次，并记录数据表格见表1(5)绘制标准曲线利用测得的数据，绘制以A500值为纵坐标，牛血清清蛋白标准液浓度为横坐标的准备曲线，具体绘制利用 excel制作，结果可见图2(6)测样品蛋白质含量根据样品管(6管)的吸光度值，在标准曲线中找到对 应的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数(300)，得出每毫升未稀 释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数 (mg/ml)。

血清蛋白浓度(g/ml)=样品蛋白质浓度^2X300参考：正常人血清蛋白浓度范围为 60~80 g/L1.3.3注意事项①试剂要求：实验所需的试剂必须是新鲜配制，不然会存在被空气及其他物质 氧化还原的情况，干扰实验的测定② 控制时间：Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时 间严格按照实验步骤的操作，规定的时间是多少就多少水浴时间也不宜过长同时, 在最后从水浴加热后取出冷却后，需及时的进行比色测定防止混合液中物质发生系列 变化和反应③ 加入Folin-酚试剂后，需要马上混合摇匀，防止磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏④ 干扰物质的影响：凡干扰双缩脲反应的基团，均可干扰 Folin-酚反应这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠一氢氧化钠浓度即可显色测定若样品酸度较高，也需提高碳酸钠一氢氧化钠浓 度1 — 2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病⑤ 绘制曲线要求：作过原点的直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均 变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲 线或直线两侧电脑Excel绘图，可以不考虑）⑥ 操作要按照实验步骤，一步一步来，防止操作问题导致的操作误差的出现等。

二、实验记录2.1实验条件 材料及试剂：本次实验的试剂和材料均是实验室配制好的，比例和浓度同实验预习， 故不再赘述实验时间表：总表实验步骤消耗时间混合溶液未计时滴加溶液静置10min室温冷却27min等待20min比色测定6mi n加Folin-酚试剂、水浴10min附表项目时刻表试管1试管2试管3试管4试管5试管6加硫酸铜8' 42” 098' 43” 208' 44” 298' 45” 458' 46” 558' 47” 55水浴8' 52” 098' 53” 208' 54” 298' 55” 458' 56” 558' 57” 55冷却等待9' 02” 099' 03” 229' 04” 299' 05” 459' 06” 559' 08” 00操作技巧：① 在这一次的实验中，关键的要点在于滴加 Folin-酚试剂的摇匀，必须快速摇匀， 保证反应优先进行振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摆动，使试管中液 体混合均匀且不漏出最后放入到水浴中加热② 在分光比色的时候，测量一次后重新凋零，不能继续测量等操作失误：全部实验过程中，就出现了一次失误，即在试管 4加入Folin-酚试剂，充分摇匀，在放 入水浴加热之间，部分液体由于磕碰而溅出。

其余操作严格按照要求一步步完成，理论 不存在着失误分析：Folin-酚与液体已经混合均匀并反应，在后面的水浴加热后，只是影响到了 整体的试管4的反应后得到的溶液量，而不影响颜色的变化及最后的比色测定，故该失 误不会对实验产生测定的偏差2.2实验现象① 在滴加硫酸铜溶液后，摇匀，产生较多的黏性气泡且附着在液体表面液体颜色 变化不深② 在滴加Folin-酚试剂水浴加热后，除试管1为淡黄色外，其余试管均成不同的蓝 色具体看下图：图一水浴后各试管的情况图分析：标准液的试管中（2-5）蓝色不断加深，同实际的标准液的含量多少正相关， 而试管6的颜色不深，在1-2试管之间，根据实验原理初步可以判定的是：该样品液的 蛋白质含量将不会在60-80g/L之间，而是在0-40g/L即实验存在一定的问题，详见结 果的分析与讨论2.3实验原始数据本次实验原始数据是在500nm的波长下，各试管混合液的吸光度值，结果见下表 1表1 500nm波长吸光度值记录 各管吸光度值A500测定次数 2 3 4 5 610.3530.5610.7440.9380.17220.3500.5620.7440.9380.17230.3510.5620.7430.9380.172各管平均值A 500三、结果与讨论3.1数据处理利用原始数据，可得到各管的平均值：2 管：A 500=( 0.353+0.350+0.351)/3=0.3513 ；3 管：A 500=( 0.561+0.562+0.562)/3=0.5617 ；依次得到4-6管的吸光度值如下所示:测定次数各管吸光度值A500234 56各管平均值A 5000.35130.56170.7437 0.93800.1720绘制蛋白质的标准曲线根据用Excel绘制标准曲线PPt所示步骤，最终得到如下结果:牛血清清蛋白浓度■吸光度标准曲线| 10000C.^QOO0.4DC00.20000.0 DOC5

y 0.1720 x 0.1720 0.0062 27.74 g/mL血清蛋白浓度（g/ml）= 样品蛋白质浓度x 2X 300故得血清蛋白浓度为16.65g/L3.2结果由上数据处理可知，最后的待测样品的蛋白质含量为16.65g/L而真正的正常人血 清蛋白浓度范围为60~80 g/L因此，存在一定问题，具体分析见 3.3分析与讨论3.3分析与讨论首先，我们回顾了整个操作过程，在整个过程中，我们基本都是按照要求操作，并不存在着明显的操作问题通过上面水浴加热后的图可以明显看到，结果的确应该在 0-20g/L之间同时我们与和我们一样使用试剂的组讨论后发现，他们的结果也是在 10几左右；同时，很多组测出的结果都偏低，故可以初步判定结果的测量方式上不存在明显冋题其次，回顾全部过程的原理，我们猜测可能存在的造成结果低的情况为：①在室温冷却后，实验室没有空余的分光光度计，排队时间应该是全部小组中最长 的，基本花去30多分钟而这也导致了最后的显色增强（其具体的显色原因可能为物 质间的复杂反应导致）从而使得最后的标准曲线的斜率增大，导致测定的标准的样品液 蛋白质含量的下降即A