实验12-质粒DNA的提取.ppt

实验七实验七 质粒质粒DNA的提取的提取 (碱法碱法)1. 实验目的2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论 实验目的l了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理；l掌握碱法提取质粒的方法掌握碱法提取质粒的方法实验原理实验原理l质粒是一种细菌染色体外的、具有自主质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型的小型DNA分子碱裂解法提取质粒是分子碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法实验室常用的方法l这种方法是根据共价闭合环状质粒这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来在拓扑学上的差异来分离它们分离它们结构的三大要素：结构的三大要素：• 多克隆位点• 选择标记（耐药性，LacZ）• 独立的复制单位种类：种类：• 质粒• 噬菌体• 酵母人工染色体（YAC）• 反转录病毒载体• 表达载体等•在碱性条件（在碱性条件（））下，线性染色体下，线性染色体DNA的双螺旋的双螺旋结构解开而变性，质粒结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。

当加两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA之间交联之间交联形成不溶性结构，而质粒形成不溶性结构，而质粒DNA分子很快复性，分子很快复性，离心时染色体离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒而质粒DNA则留在上清液中则留在上清液中•用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒粒DNA实验仪器、材料与试剂 （一）（一） 仪器仪器 1.  恒温摇床 2.  超净工作台 3.  高压灭菌锅 4.  高速台式离心机 5.  微量取液器 （二） 材料 l含重组质粒的大肠杆菌 （三） 试剂 l1. LB液体培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟 lLB固体培养基（1L） 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g l2. SolutionⅠ 　50 mmol/L 葡萄糖    　 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0)    　 10 mmol/L EDTA () 高压灭菌后，4℃保存备用。

l3. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH    　   1%  SDS •4. Solution Ⅲ（100 ml）        5mol/L  KAc 60 ml         冰醋酸 11.5 ml          水 28.5 ml 配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （） •5. 氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用 6. 胰胰RNA酶酶 l  将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L  (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，  配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃ 7. 氯仿，乙醇氯仿，乙醇 ，70%乙醇乙醇缓冲液        10mM  (pH7.4)         1mM EDTA (pH8.0)实验步骤实验步骤 l1. 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp  0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜 l2. 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，12,000 rpm离心2min，去掉上清液。

将EP管口朝下，用滤纸吸干水分l3.沉淀悬于100μL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮，盖子打开，室温放5分钟 l4. 加入200μL SolutionII，混匀（注意动作轻），冰浴5分钟 l5. 加入1μL RNase和150μL SolutionIII，上下颠倒5-10次，冰浴10分钟 l6. 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，注意所取体积 l7. 加入2倍体积无水冰乙醇混匀（注意动作轻），-20℃沉淀 10min l8. 12,000 rpm离心3 min，弃上清，加入1ml 70%乙醇振荡漂洗一次，再10000 rpm离心2min，去上清l9.沉淀于-20℃保存备用lBiospin 质粒DNA 小量提取试剂盒（实际用）用）l l操作过程操作过程l1. 将1～1.5ml 过夜培养的细菌菌液加入1.5ml 离心管中l2. 于10，000rpm离心30 秒，并弃去上清液l如有需要，可多次重复步骤1、2，以收集更多细菌菌体但勿过量，以免影响提取质粒的质量l3. 加250μl Resuspension Buffer，重悬细菌体沉淀l重悬后应该没有细菌团块。

l4. 加250μl 细胞Lysis Buffer，轻柔颠倒4～6 次l不要剧烈振动，以防止基因组DNA 被剪切注意不要让反应持续超过5 分钟l5. 加350μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒离心管4～6 次l溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀l6. 于13,000rpm离心10 分钟l如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀l7. 将步骤6 离心后得到的上清液转移到Spin column 内于6,000rpm离心1 分钟，并弃去接液管内液体l8. 向Spin column 内加650μl Wash Buffer，于12，000g 离心30～60 秒，并弃去接液管内液体l9. 重复第8 步一次l10. 再次于12，000rpm 离心1 分钟，然后将Spin column 转移到无菌的1.5ml 离心管中如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除l11. 向Spin column 内加20μl Elution Buffer、去离子水或TE 溶液，并于室温静置1 分钟l可根据实验的实际需要决定洗脱液用量l12. 于12，000rpm离心1 分钟，1.5ml 离心管内溶液中含有质粒DNA。

l13. 提取的质粒DNA 可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃实验结果及讨论 l碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作法之一，提取量较大，便于操作l如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。