黑曲霉发酵柠檬酸.doc

黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北）生物技术 18083108 陈园园摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂：样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处）培养基：查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4实验器材：无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1.黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。

编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板③制备土壤稀释液：1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液 2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水取10－1的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液同法依次连续稀释至10－3、10－4土壤稀释液无菌操作法分别吸取10－2、10－3 、10－4土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块查氏平板培养基上④涂板用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置于桌面5min2.黑根霉的分离培养马铃薯培养基2块1号马铃薯培养基用接种环无菌操作从酒酿样品中挑取1环在上面进行划线分离，2号马铃薯培养基取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻璃珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL在上面进行均匀涂布将划好的培养基置于517房间30℃培养箱内正置培养3天，进行结果观察和转接。

3.菌种检测和扩培培养72小时后，星期一过来，检查查氏培养基和划线马培，看是否有产酸的曲霉菌落，和典型的根霉菌落，并显微检测其是否为黑曲霉和黑根霉确证后分别将其转接至剩余的两块PDA平板培养基上扩增培养和保藏二．黑曲霉发酵柠檬酸1.种子液制备菌种获得（纯种），无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上，用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制成孢子悬液2.液体深层发酵无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇瓶发酵培养基中在转速为200rpm旋转摇床上，30℃培养5～6天 三．柠檬酸的提取把发酵完成后的发酵液中的目的产物提取出来，并通过精制成为合格产品，该过程通常称为后提取，后提取是发酵工程不可缺少的部分 1、处理黑曲霉玉米粉发酵液：布氏漏斗垫上纱布抽滤除去菌体和残渣，量筒测量清液体积 V0；2、滴定：量取5mL清液、5mL蒸馏水于锥形瓶中，再滴入2～3d酚酞指示剂，用0.1M NaOH 溶液滴定，滴定终点为淡红色，30s内不褪色，记下消耗的NaOH 溶液体积V1；M总酸（g）＝V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210× V0 /5M碳酸钙（g）＝M柠檬酸×（ V0 －5）/ V0 ×1/210×3/2×1003、钙盐沉淀：称取一定质量的碳酸钙粉末，边搅拌边缓慢地加入到剩余的清液中（防止产生大量的泡沫），85℃反应5min（使柠檬酸钙沉淀下来），趁热抽滤，并用沸水洗涤沉淀物2～3次（除去残糖、蛋白质等可溶性杂质）；4、酸解：VH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000在沉淀物中加入约两倍体积的蒸馏水，调匀成浆状，量取一定体积0.1M H2SO4溶液，边搅拌边加入到浆液中，85度反应10min，趁热抽滤，获得清亮的酸解液；5、 低压浓缩：将酸解液转入圆底烧瓶中，水浴60～70度，真空度0.08~0.09MPa，浓缩至原体积约1/10；6、冷却结晶：将浓缩液转入烧杯中，于室温下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约15min，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重m柠檬酸。

计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/ V发酵液（mL）计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率：m柠檬酸（g）/ 原料（g） 实验结果：1.黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养结果黑曲霉菌丛黑褐色，菌丝发达多分枝，顶囊大球形，分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一黑根霉菌落呈黑色灰色菌丝为白色呈絮状，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成球形的孢子囊2.柠檬酸的提取结果柠檬酸呈白色结晶粉末V0=125ml V1=7.8mlM总酸（g）＝V1(mL)×0.1(mol/L)×0.001×1/3×210× V0 /5M总酸（g）＝7.8×0.1×0.001×1／3×210×125／5=1.365gM碳酸钙（g）＝M柠檬酸×（ V0 －5）/ V0 ×1/210×3/2×100M碳酸钙（g）＝1.365×110／125×1／210×3／2×100=0.86gVH2SO4（mL）＝M碳酸钙/100/0.1(mol/L)×1000VH2SO4（mL）＝0.86／100／0.1×1000=86 ml计算黑曲霉发酵柠檬酸的产率：M总酸（g）/ 原料（g）黑曲霉发酵柠檬酸的产率=1.365／10.0=13.65％计算钙盐沉淀法柠檬酸的得率：m柠檬酸（g）/ M总酸（g） 钙盐沉淀法柠檬酸的得率=0.56／1.365=41％讨论：本次实验目的为掌握真菌的分离、培养基本方法；获得黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸；了解产物发酵生产的机理；柠檬酸发酵的发酵条件；掌握发酵过程步骤；了解产物提取的几种方法；学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理；掌握沉淀法提取柠檬酸的方法。

1.土壤样品的采集需注意以下因素根据土壤特点1．土壤有机质含量和通气状况2.土壤酸碱度和植被状况3．地理条件4．季节条件根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型2.根据微生物的生理特性2.柠檬酸合成的代谢调节1、由于锰离子的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的NH4+ 浓度升高，促进了EMP途径的畅通2、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸3、在控制Fe2+含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累4、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶Ａ和丙酮酸固定CO２反应相平衡，以及柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力5、柠檬酸积累增加，pH降低，在低pH条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累3.柠檬酸发酵的条件：1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖等），高浓度的糖；2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源（铵盐）；3、合适的pH值；4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速250r/m）；5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含量4.影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素①菌种②发酵培养基（碳源、氮源）③纯种发酵与灭菌④无机添加剂⑤pH对微生物生长的影响⑥溶氧的影响⑦温度对微生物生长的影响5.影响柠檬酸提取效率的因素钙盐沉淀中是否充分沉淀；可溶性杂质是否完全除去；多次抽滤操作中抽滤是否充分；冷却结晶是否充分。