维生素c增强as2 o3 诱导宫颈癌hela细胞凋亡的研究_1.docx

从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果维生素C增强As2 O3 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究［摘要］目的: 探讨维生素C是否能 影响 三氧化二砷诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，以及它对细胞内端粒酶活性的影响 方法 : 用噻唑蓝法筛选出维生素C的最佳浓度250μmol・L -1 ，并用该浓度联合不同浓度的AsO同时处理HeLa细胞后，用光镜、MTT法和流式细胞术 研究 细胞生长和凋亡的情况，用法检测细胞内端粒酶活性的变化 结果: 单独1μmol・L -1 AsO处理过的细胞生长未受到明显抑制，但联合250μmol・L-1 维生素C处理细胞，则细胞生长受到抑制，且部分细胞出现凋亡形态学特征2、5、10μmol・L-1 AsO联合维生素C用药组的细胞凋亡率也比单独用As O 组明显增高，且出现凋亡的时间提早端粒酶活性检测结果提示，联合用药组细胞内端粒酶活性均明显比单独用AsO组低 结论: 小剂量维生素C能增强AsO 诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，并能增强AsO对细胞内端粒酶活性的抑制作用 ［关键词］ 维生素C;三氧化二砷;HeLa细胞;细胞凋亡;端粒酶 维生素C是 自然 界广泛存在的一种抗氧化剂，但近来研究表明维生素C不仅有抗氧化作用而且表现出一定的亲氧化作用［1］ 。

三氧化二砷是中药砒霜的主要成分，具有一定的抗肿瘤作用最近有研究显示维生素C可增强As O诱导白血病细胞凋亡的作用［2～4］ ，这种增强作用被认为可能与降低细胞内还原型谷胱甘肽水平和提高细胞内活性氧类水平有关［3，4］ ，但具体机制不十分明确本研究小组前期的工作显示AsO能诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，这一作用可能与其抑制端粒酶活性有关［5］ 本研究旨在进一步研究维生素C对AsO诱导HeLa细胞凋亡的影响，以及维生素C联合AsO对宫颈癌HeLa细胞内端粒酶活性的影响 1 材料和方法 试剂AsO用1mmol・L-1 NaOH将其完全溶解，调pH至，用灭菌双蒸水配制成10mmol・L-1 溶液，4℃贮存，使用时用RPMI1640培养液稀释为工作浓度噻唑蓝和HEPES购自Amresco公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，维生素C购自Sig- ma公司，小牛血清购自杭州四季青公司，试剂盒来自Roche公司，试剂盒来自Promega公司 1.细胞培养及形态观察HeLa细胞株购自 中国 科学 院上海细胞生物研究所细胞库，用含10%小牛血清和100U・ml-1 青霉素、100U・ml -1 链霉素和HEPES的RPMI1640培养液，在37℃、体积分数为的CO 培养箱中培养，每隔2～3d传代1次。

实验选用对数生长期的细胞，用%胰酶和%EDTA混合消化液消化，用培养液稀释成单细胞悬液，以4000个细胞・孔-1 接种于96孔板中，16～24h用以下两种方法处理:一种单加不同浓度As O ，另一种250μmol・L -1 维生素C加不同浓度AsO，不加药组作为空白对照，每组6个平行孔，加药后每天用相差显微镜观察并记录用药组和对照组的细胞形态变化 检测 维生素C浓度的筛选 细胞准备方法同16～24h分别按以下分组加药:2μmol・L-1 As O 组、2μmol・L-1 AsO 加不同浓度维生素C组和对照组，再在同样条件下培养48h后每孔加入20μl MTT后在同样条件下培养4h，弃去孔内液体，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，在酶标仪上测定波长为492nm处的光吸收值，每组设6个平行孔，取平均值，以×100% 计算 细胞存活率实验重复3次以上 不同浓度AsO联合维生素C对细胞生长的影响细胞准备方法和药物处理方法同药物处理细胞48h后作MTT检测，实验重复3次以上 1.流式细胞术检测选用对数生长期HeLa细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种5×10个细胞，16～24h用以下两种方法处理:一种单加As O ，另一种250μmol・L-1 维生素C加AsO ，在此条件下培养48h后消化液消化，Hank液终止消化收集细胞;PBS洗2次，1000r・min-1 离心5min，将70%冷乙醇缓慢滴入试管，并不停震荡试管，使细胞分散固定;PBS洗涤后弃上清，加入1%，摇匀后静置10min，1500r・min-1 离心5min，弃上清;加入%Rnase消化10min，1500r・min-1 离心5min，弃上清;加入%的碘化丙锭染色15min，用300目丝网过滤后上机 分析 。

每样本设立3管重复样本 1.端粒酶活性检测端粒酶的活性检测按Roche公司提供的说明书操作选用对数生长期HeLa细胞制备成单细胞悬液，每瓶接种5×10 个细胞，培养16～24h加药处理48h后收集细胞，用PBS洗两次，4℃3000r・min-1 离心5min;沉淀细胞中加入端粒酶提取液200μl，冰上孵育30min后4℃16000r・min-1 离心20min，取上清液置于另一Eppendorf管中，-70℃保存;取2μl上清液，再加入25μl 扩增液，用DEPC水补充体积至50μl，瞬时离心后在PCR仪上延伸和扩增;PCR扩增程序为:引物延伸，端粒酶灭活，扩增反应取上述PCR产物5μl，加变 性液20μl，混匀，置室温10min，加入225μl杂交液，混匀后取100μl加入抗生物素覆盖过的微孔板中，37℃混匀杂交2h;每孔加入100μl过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体，室温下混合反应30min;每孔加入100μl POD酶的底物TMB，室温下混合反应15min后加100μl终止液终止反应，在酶标仪上测定450和690nm波长处的A值A差值△A=A50 -A90 代表细胞内端粒酶活性。

阳性对照为试剂盒提供的人胚肾293细胞株的端粒酶提取液，其PCR产物经ELISA检测，△A>为阳性阴性对照为HeLa细胞提取液，于65℃加热10min以灭活端粒酶，其PCR产物经ELISA检测，△A 1.统计学处理 所有数值以ˉx±s表示，统计分析使用SPSS软件，数据使用t检验分析流式细胞仪检测结果用百分数表示 结果 .1 AsO联合维生素C对细胞凋亡的形态学影响HeLa细胞经As O和维生素C处理后，在相差显微镜下观察到单独1μmol・L-1 的As O处理HeLa细胞48h，与对照组相比细胞生长无明显差异，但联合250μmol・L-1 维生素C后可见细胞生长明显受到抑制，细胞数减少单独2μmol・L-1 的As O 作用HeLa细胞24h后未见明显的凋亡形态特征，只有48h后才出现明显生长抑制和凋亡现象，但联合250μmol・L-1 维生素C组，24h即可见细胞变圆，细胞间距逐渐增大，出现部分细胞的凋亡形态学特征，细胞皱缩变圆5、10μmol・L-1 AsO 联合250μmol・L -1 维生素C处理的细胞上述变化都比单独AsO 作用组明显 .AsO联合维生素C对细胞存活率的影响 . MTT法检测 . 不同浓度维生素C联合As O对细胞的影响 用2μmol・L-1 AsO联合不同浓度的维生素C同时处理HeLa细胞48h，结果显示2μmol・L-1 AsO明显降低HeLa细胞的存活率，联合μmol・L-1 维生素C与单独用AsO组比较，细胞存活率即有下降;联合125μmol・L-1 维生素C与单独用AsO组比较，细胞存活率下降更明显;联合250μmol・L-1 维生素C，细胞存活率较联合125μmol・L -1 维生素C时进一步下降;当A.对照组;μmol・L-1 AsO;μmol・L-1 AsO +250μmol・L-1 维生素C;μmol・L -1 AsO;μmol・L-1 As O +250μmol・L-1 维生素C图1 光镜下单独AsO 或As O加维生素C作用于HeLa细胞48h的形态学改变 ×100联合500μmol・L-1 维生素C细胞存活率下降就更明显，且随维生素C浓度的加大，细胞存活率下降越来越明显。

但当维生素C浓度大至1000μmol・L-1 后，差异就不太显著了，P>同时我们在检测单独不同浓度的维生素C对HeLa细胞的影响时发现，单独500μmol・L-1 维生素C也能诱导HeLa细胞凋亡，而单独250μmol・L -1 维生素C却不能诱导HeLa细胞凋亡，因此我们选定250μmol・L-1 维生素C作为我们的联合用药浓度 .不同浓度As O联合维生素C对细胞的影响 经不同浓度的AsO单独处理HeLa细胞48h，以及其联合250μmol・L-1 维生素C处理HeLa细胞48h后进行MTT检测我们发现，单独1μmol・L-1 的AsO作用于HeLa细胞48h对细胞增殖影响不十分明显，但联合250μmol・L-1 维生素C作用后细胞存活率则明显降低;2、5、10μmol・L-1 的AsO 联合250μmol・L-1 维生素C处理细胞的存活率均比单独As O处理组低，且随着As O浓度的加大差异越来越显著1.对照组; .2μmol・L-1 AsO 组;3～10.分别对应2μmol・L-1 AsO联合、125、250、500、750、1000、XX、4000μmol・L -1 维生素C组 A.不同浓度维生素C联合2μmol・L-1 As O对细胞 的影响B.不同浓度AsO单独或联合250μmol・L-1 维生素C对细胞的影响图维生素C和AsO对HeLa细胞生长的影响 .2.流式细胞术检测HeLa细胞经AsO和维生素C处理48h后，作流式细胞分析发现对照组、单独250μmol・L -1 维生素C处理组未出现DNA含量明显低于G1 期的亚G1 期的凋亡峰，而5μmol・L-1 的As O、250μmol・L-1 维生素C加5μmol・L -1 的AsO 处理组细胞出现明显的凋亡峰，且联合用药组细胞凋亡 率明显比单独用AsO组的凋亡率高，分别为% 和%。

A.对照组;μmol・L -1 维生素C;μmol・L-1 AsO;μmol・L-1 AsO+250μmol・L-1 维生素C 图As O 联合维生素C作用于HeLa细胞48h流式细胞仪检测结果 .As O 联合维生素C对细胞内端粒酶活性的 影响 单独用0、1、2、5、10μmol・L-1 As O和用上述这些浓度的As O联合250μmol・L-1 维生素C处理HeLa细胞48h后检测细胞内端粒酶的活性，表1结果显示1μmol・L-1 组端粒酶活性抑制不明显，但联合维生素C作用后，其端粒酶活性抑制明显增强;2、5、10μmol・L-1 AsO组可明显抑制端粒酶活性，但这种抑制作用能被250μmol・L-1 维生素C增强，这种增强作用在统计学上有显著性差异可见端粒酶活性的变化在维生素C增强As O诱导HeLa细胞凋亡途径中发挥非常重要的作用 　讨 论 维生素C是具有许多生物学功能的水溶性的葡萄糖类物质，是具有6个碳原子的酸性多羟基化合物，在一定条件下其分子中2位和3位碳原子的两个烯醇式羟基可解离释放出H+ ，使维生素C被氧化成脱氢维生素C这种氧化型与还原型维生素C之间可相互转变，在生物组织中形成一个氧化还原体系。

但在某 表1 维生素C联合As O 对HeLa细胞端粒酶活性的影响单独用对应浓度的AsO组比较，P Sestili等6］ 认为高剂量维生素C有亲氧化作用，低剂量有抗氧化作用维生素C的这种双重作用使它在肿瘤防治中发挥着非常重要的作用，它既能防止化疗药物对正常组织的损伤作用［7］ ，又能协同化疗药物诱导肿瘤细胞的凋亡［8］ 近年来 研究 显示AsO具有一定的抗肿瘤作用，本研究小组也已实验证明它能诱导肿瘤细。