溶血性曼氏杆菌重要抗原的免疫原性分析.docx

    溶血性曼氏杆菌重要抗原的免疫原性分析    陆奕彤　李垚　杨发龙Summary：旨在通过分析溶血性曼氏杆菌重要抗原的免疫原性，为疫苗和诊断试剂研制提供依据在生物信息学分析的基础上，构建溶血性曼氏杆菌lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2和gs60基因的原核重组表达载体，并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，获得重组蛋白质随后用被抗溶血性曼氏杆菌感染的绵羊血清进行Western-blot和酶联免疫吸附测定（ELISA），评价各蛋白质的免疫原性并筛选优势免疫原;用各重组蛋白质免疫小鼠，评价免疫小鼠后诱导其产生的抗体水平，以评价各重组蛋白质作为重组疫苗的潜在价值Western-blot和ELISA检测结果表明，各重组蛋白质均具有良好的免疫原性，其中rLktA、rOmpA、rGs60与感染的绵羊血清结合能力最强，为优势免疫原;各重组蛋白质免疫小鼠后均能诱导其產生体液免疫应答，其中rOmpA、rPlpE和rPlpF免疫小鼠后诱导其产生的抗体在免疫后35 d仍能与全菌蛋白质结合研究结果为溶血性曼氏杆菌感染血清学诊断试剂的开发和新型疫苗的研制提供了重要的试验数据Key：溶血性曼氏杆菌;重要抗原;免疫原性：S852.61+2：A：1000-4440（2022）02-0446-07Immunogenicity analysis of major antigens of Mannheimia haemolyticaLU Yi-tong，LI Yao，YANG Fa-longAbstract：The purpose of this study is to compare and analyze the immunogenicity of major antigens of Mannheimia haemolytica， and to provide a basis for the development of vaccines and diagnostic reagents. Based on bioinformatics analysis， prokaryotic expression vectors of lktA， ompA， plpE， plpF， ompP2 and gs60 genes were constructed and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）， and recombinant proteins were expressed and purified. Subsequently， Western-blot and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were performed by using sheep anti-Mannheimia haemolytica serum to evaluate the immunogenicity of each protein， and to screen the dominant immunogens. Meanwhile， mice were immunized with each recombinant protein， and the antibody levels were tested to evaluate potential value of each protein as a recombinant vaccine. The results demonstrated that all tested proteins were good immunogens， while rLktA， rOmpA and rGs60 showed the strongest binding ability to infected sheep serum， suggesting that they were the dominant immunogens of Mannheimia haemolytica. All recombinant proteins could induce humoral immune response in mice， while rOmpA， rPlpE and rPlpF could induce high titer antibody after 35 days post immunization. These results provide important data for developing serological diagnostic tools and new vaccines.Key words：Mannheimia haemolytica;important antigen;immunogenicity溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）属于巴氏杆菌科曼氏杆菌属，是一种革兰氏阴性兼性厌氧球杆菌。

其作为一种条件致病菌，溶血性曼氏杆菌常存在于牛、羊等反刍动物上呼吸道中当动物受到一些应激因素（如天气骤变、长途运输或病毒、支原体感染等）影响，造成机体免疫能力下降时，溶血性曼氏杆菌便可入侵动物肺部，引起动物发生严重的肺炎[1-2]溶血性曼氏杆菌是公认的引起牛呼吸道综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病原[3]近年来，越来越多的研究发现，溶血性曼氏杆菌同样是导致绵羊和山羊等小反刍动物发生呼吸道疾病的重要病原[4]，还可以导致羔羊败血症和母羊乳房炎的发生[5-6]目前，中国还缺乏针对溶血性曼氏杆菌的使用广泛且安全有效的商品化疫苗，同时也没有特异、敏感的血清学诊断试剂，而国外使用的商品化疫苗仅能提供部分免疫保护[7]因此，有必要对溶血性曼氏杆菌的病原特征及其重要的免疫原进行深入研究，从而有助于溶血性曼氏杆菌新型疫苗和血清学诊断试剂的研制国内外研究者已经在溶血性曼氏杆菌免疫原方面进行了一些相关研究，发现白细胞毒素（LKT）及OmpA、PlpE等多个外膜蛋白质等均具有良好的免疫原性，可诱导机体产生一定的免疫保护作用[8-10]然而，虽然上述研究对一些潜在的诊断抗原和疫苗的候选蛋白质进行了评价，但对于其中哪些可以作为优势免疫原诱导机体产生高水平免疫应答尚不清楚。

此外，相关研究多以牛源菌株为对象，分析其感染牛后诱导牛产生的免疫应答情况，而对溶血性曼氏杆菌感染羊后诱导羊产生的免疫应答情况的报道甚少本研究分析比较了溶血性曼氏杆菌感染羊后LktA、OmpA、PlpE、PlpF、OmpP2、Gs60等6个重要免疫原在羊体内诱导产生的抗体水平以及这些免疫原的重组蛋白质在小鼠体内诱导产生的免疫应答水平，从而为血清学诊断试剂的开发和新型疫苗的研制提供有用的试验数据1材料与方法1.1菌株、载体及血清溶血性曼氏杆菌临床分离株S4由笔者所在实验室（西南民族大学青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室）分离鉴定和保存;pET-28α（+）载体为Novagen公司产品;大肠杆菌E.coil DH5α、BL21（DE3）感受态细胞为天根生化科技（北京）有限公司产品;35份溶血性曼氏杆菌感染绵羊血清及3份阴性血清由笔者所在实验室收集并保存1.2主要试剂氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自美国Sigma公司;金牌Mix（green）Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×）购自北京擎科信业生物公司;核酸相对分子质量标准DNA marker、蛋白质相对分子质量标准品、限制性内切酶Bam HⅠ、XhoⅠ与T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司;Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit、Cycle Pue Kit购自美国Omega公司;镍金属螯合亲和[组氨酸（His）标签蛋白]蛋白质纯化柱购自常州天地人和生物科技有限公司;27 mm透析袋（相对分子质量：35 000）购自广州赛国生物科技有限公司;辣根过氧化物酶（HRP）标记驴抗绵羊、HRP标记山羊抗鼠、SuperLumia ECL HPR Substrate Kit购自美国Abbkine公司;磷酸缓冲盐溶液（PBS）、酶标抗体稀释液、血清稀释液、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）显色液、终止液购自武汉博士德生物工程有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白质定量试剂购自江苏凯基生物技术股份有限公司;酶标板购自Corning公司。

1.3引物设计为制备原核表达重组蛋白质，对ompA、plpE、plpF、ompP2、gs60基因全长编码序列（CDS）进行克隆;对于lktA基因，对其2 019～2 819位核苷酸编码序列进行截短表达PCR扩增引物用Primer Premier 5軟件设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具体信息见表11.4PCR扩增采用常规酚-三氯甲烷法从溶血性曼氏杆菌S4株中提取总DNA作为模板，利用表1中的引物对各基因片段进行PCR扩增反应总体系为20 μl，包括Mix（green）Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×）（5 U/μl）10 μl，上游引物、下游引物各1 μl，DNA模板2 μl，去离子水6 μl反应条件：95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s，退火30 s（lktA、ompA、plpF、plpE、ompP2、gs60基因对应的退火温度分别为60.0 ℃、58.0℃、63.0 ℃、57.7 ℃、57.8 ℃、55.9 ℃）;72.0 ℃延伸（其中gs60基因延伸1 min 30 s，其他基因均延伸40 s），共35个循环;72.0 ℃延伸10 min，16 ℃结束反应。

PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测1.5原核表达载体的构建利用Gel Extraction Kit对上述各PCR产物进行回收纯化随后用限制性内切酶Bam HⅠ、Xho Ⅰ对pET-28a（+）载体及纯化的目的片段进行双酶切利用Cycle Pue Kit纯化酶切产物，采用T4 DNA连接酶进行连接反应将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，然后将重组质粒DH5α工程菌涂布于含有卡那霉素（50 μg/ml）的LB琼脂选择培养基上第2 d挑取疑似阳性菌落，利用质粒提取试剂盒Plasmid Miniprep Kit对其进行质粒提取，随后进行PCR鉴定和Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，将鉴定为阳性的样本送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序确认1.6重组蛋白质的诱导表达和可溶性分析将pET-28a（+）-X转化至Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞中，获得表达工程菌，将表达工程菌菌种按1∶100的体积比接入100 ml LB液体培养基（卡那霉素质量浓度为50 μg/ml）中，将终浓度为1 mmol/L的IPTG于37 ℃诱导表达9 h，然后取2 ml菌液，于8 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集菌体，经pH值为7.4的PBS重悬，与等体积的2×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上样缓冲液混合，加热煮沸5 min，通过含量为12%的分离胶进行SDS-PAGE检测。

将检测正确的样本在冰水浴中通过超声波破碎仪于400 W破碎20 min（超声2 s+暂停6 s为1个循环），破碎后于12 000 r/min、4 ℃离心15 min，分别收集沉淀、上清取少许沉淀，经pH值为7.4的PBS重悬，然后将沉淀、上清均用含量为12%的分离胶进行SDS-PAGE，对重组蛋白质进行可溶性分析1.7重组蛋白质的纯化将上述诱导表达。