染色体组型分析ppt课件.ppt

遗传学学实验之之—— 染色体染色体组型分析型分析厦门大学生命科学学院厦门大学生命科学学院 实验目的：n掌握染色体组型分析的各种数据目的n学习染色体组型分析的根本方法实验原理n定义：染色体组型又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群〔亚种、种、属等〕的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征陈列起来的图像n核型方式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形状等特征陈列起来的图像开展历史n1920年提出n三项技术促进：低渗处置n                            秋水仙素运用n                            植物凝激素运用n染色体分带技术：Q带、G带、C带、R带、T带、N带等nFISH技术染色体的特征n数目  〔2n=？〕n长度   〔绝对长度、相对长度〕n着丝粒位置   〔M\SM\ST\T〕n随体与次溢痕的数目、大小和位置n带型分析各类常用实验生物和人细胞DNA含量与染色体数目物   种染色体数目DNA含量〔bp〕MS2λ噬菌体T4枯草杆菌大肠杆菌啤酒酵母果蝇海胆蛙小鸡小鼠玉米人111113485226784020463×1035×1045×1052×1064.2×1061.4×1071.4×1081.6×1094.5×1092.1×1094.7×1093×1093.2×109染色体超螺旋染色体的大小灯刷染色体〔光镜察看〕染色体察看及核型分析应意图义n染色体组型分析——染色体程度上的表型n可确定物种的特征，确定种属亲缘关系n分析生物物种的变异和进化过程n识别单条染色体、基因定位n临床运用〔染色体疾病、产前诊断〕人类人类23对染色体对染色体组型分析实验方法n染色体数目确定n染色体形状特征：n    长度：绝对、相对n     相对长度=每条染色体的长度/全套染色体长度n    臂比=长臂/短臂n    着丝点指数=短臂/〔长+短臂〕n    随体的有无分组排队原那么n着丝粒类型一样，相对长度相近的分一组n同一组的按染色体长短顺序配对陈列n各指数一样的染色体配为一对n可根据随体的有无进展配对n将染色体按长       短排队，短臂向上实验用品n毫米尺、剪刀、胶水、计算器、白纸n人染色体放大照片染色体编号(人X染色体)记述一特定带时，需求写明4个内容：染色体号，长短臂，区的号序和带的号序。

这些内容按顺序写，不用间隔或加标点假设某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号原那么仍按从着丝粒往臂端序贯编号如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带核型描画n首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形状以下一致的命名符号：nA-G    染色体组的称号n1-22   染色体编号nX,Y     性染色体ndel      缺失nder      构造重排的染色体ndup     反复ninv      倒位nt          易位n+/-      在染色体符号前表示染色体添加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或短少一部分实验步骤1.计数，沿边缘剪下染色体，编号2.初步目测配对，分组3.丈量长度，计算相对长度、着丝粒指数、  臂比，一样的染色体间配对4.将配对好的染色体陈列并粘贴在纸上，每一组下面画一横线，在两端注明起止号，并在横线下的中部写明A-G组号，染色体从大到小编为1-22号，性染色体单独列为一组思索题n请描画核型：n     45，XY, der (14;21) (q21;q14)n     47，XY, +21生命科学中的生命科学中的“钓鱼〞〞 〔〔FISH〕技〕技术 遗传及分子生物学实验新技术新方法系列讲座遗传及分子生物学实验新技术新方法系列讲座 开展历史n荧光原位杂交技术(fluorescence in situ Hybridization,FISH)问世于70年代后期,其曾多用于染色 体异常的研讨,近年来随着FISH所运用的探针种类的不断增多,特别是全COSMID探针及染色体原位抑制杂交技 术的出现,使FISH技术不仅在细胞遗传学方面,而且还广泛运用于肿瘤学研讨,如诊断、基因定位等放射性同位素原位杂交技术n原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺陷，诸如每次检验需重新标志 、已标志的探针表现出明显的不稳定性 、需求较长时间的曝光时间和对环境的污染等。

在察看结果时，需求较多的分裂相进展统计学分析此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，能够引起计数上的误差等FISH的根本原理n很简单, 就是标志了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交, 经过察看荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况. 荧光原位杂交〔FISH〕n FISH技术是常规染色体分析的辅助手段它是用荧光素标志特异探针，与染色体做杂交后，根据特异的荧光信号来判别结果n它可用于标志染色体的识别、特异交融基因的检测、新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复杂的染色体构造异常FISH具有其不可比较的优点：1.操作简便，探针标志后稳定，一次标志后可运用二年2.方法敏感，能迅速得到结果3.在同一标本上，可同时几种不同探针4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或构造变化的研讨，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改动的研讨FISH的技术特点：的技术特点：nFISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片n生物素〔Biotin〕地高辛〔digoxigenin 〕, dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl fluorene(AAF)均可用于探针标志。

直接标志和间接标志 n用生物素或地高辛标志称为间接标志, 杂交后需求经过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号, 因此 步骤较多, 操作费事, 其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反响扩展n直接用荧光素标志DNA的方法称为直接标志. 由于直接标志的探针杂交后可马上察看到荧光信号, 省去了烦琐的免疫荧光反响, 不再需求购买荧光抗 体, 也由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改良和提高, 直接标志的荧光探针越来越成为首选, 并采用多种不同颜色的荧光, 方便在同一标本上同时检测多种异常. 其荧光强度 和信号大小都易于在普通荧光显微镜下察看, 使FISH过程变得简便而易于操作. 探针标志n在知探针DNA构造及序列情况下可采用PCR或RNA逆转录法标探针通常用Biotin标志的探针应大于100bp，较小的探针可采用PCR技术来标志n近年来，VYSIS公司胜利的生 产了大片段的DNA探针〔100─400kb〕由于探针较长，故可将荧光物质直接标志在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号加强染色体着丝粒荧光染色体端粒荧光多色信号采集n常规的荧光显微镜的荧光显微镜的照像， 彩色胶片不易多次曝光，限制了这种结合标志探针的运用，运用CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统交融各次得到的影像，最终构成一个复合的多颜色的图像。

FISH和G显带技术结合n对已做过G显带的染色体片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更明晰的识别各条染色体及染色体构造异常〔包括某些复杂的易位，插入，倒位等〕,不仅可以用新近G带外理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子因此，FISH技术可胜利的协助细胞遗传学家做出回想性分析FISH技术和其他技术的结合nFISH技术和RFLP结合，可以准确地描画原属于染色本长短臂等构造改动和染色体核形或复杂片段的性质nFISH和细胞免疫化学技术结合，可以同时用多种颜色反响不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点转录和翻译和产物，有助了解核苷酸构造功能以及表达产物之间关系的研讨多色荧光原位杂交〔M-FISH〕nM-FISH相当于在 一次杂交中给每一条染色体都涂上了不同的颜色, 因此很容易就可看到多条染色体间的复杂易位情况和确定标志染 色体的来源. nM-FISH是2019年才建立的一种新技术运用5种荧光染料按比例标志探针，杂交后构成24条染色体上24种特异的荧光颜色以供核型分析它为人们提供了既丰富又完善的细胞遗传学信息，包括确定标志染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位 。

多色荧光染色体显带〔Rx-FISH〕n 能否让每条区带也杂交上不同的颜色呢? 这一想法导 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的诞生.n Rx-FISH技术是采用多种荧光素标志与人类DNA有高度同原性猿的DNA作为探针，杂交后使人类的24条染色体上呈现特异的带型这样便可根据彩色的荧光条带进展核型分析比较基因组杂交〔CGH〕 nCGH不需求制备患者的染色体标本, 只需采用肿瘤患者的基因组DNA和正常人的基因组DNA作为探针，与正常人的中期染色体分裂相进展杂交比较两种探针所标的荧光信号的强度比率来判别肿瘤患者的DNA能否存在缺失、添加或复制 因此CGH最适宜于检测实体瘤, 淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病. nCGH另一无法替代的优点是, 它可在一次杂交中检测整个基因遗传 物质的添加或减少, 但精度有限, 对微小的扩增或缺失检测不出, 仅适用于对整个基因组进展筛查. CGH也无法发 现平衡染色体易位. FISH的临床运用n在细胞遗传学检查中，反复序列的探针运用最多，它们是α卫星DNA、β卫星DNA和经典卫星DNA探针nα卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒nβ卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及染色体的异染色质 周围。

n经典卫星DNA有着AATGG短片段，位于染色体1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围，后两处探针除了可用于染色体数目检查外，还可用于上述部位精细改动的检查FISH的临床运用n白血病检测中常用的FISH探针有单一序列探针, 着丝粒探针, 整条染色体探针, 常用方法有单标志FISH, 双 标志FISH, 比较基因组杂交(CGH), M-FISH 和Rx-FISH等.各种FISH探针及方法均在白血病的诊断, 治疗监测, 预后估计和微小残留病检测中起重要作用 运用实例 n常规的染色体核型分析已广泛用于各类急、慢性白血病患者的骨髓染色体检查如M3型的t〔15；17〕、M2b型的t〔8；21〕、CML和部分ALL的Ph染色体等n FISH技术已胜利地用于t〔15；17〕，t (8；21) 和Ph染色体等的检测，并为人类基因组实验室发现的新基因进展了定位利用染色体涂抹技术，结合常规核型分析和CGH技术，确诊了多例复杂的染色体异位已用CGH技术，分别对高二倍体ALL的患者和CML患者进展了研讨CGH技术在实体瘤的DNA研讨中有其独特的优势n Rx-FISH和M-FISH都是目前细胞遗传学中最先进的研讨手段。

对于肿瘤性疾病包括白血病和实体瘤中极其复杂的染色体异常的检测有着不可替代的作用染色体制片技术n骨髓细胞和外周血细胞制片技术n直接制片法：直接取骨髓细胞经空气枯燥法制片n外周血淋巴细胞制片：n快速法   先注射秋水仙素-低渗-固定-枯燥n培育法   取血加植物凝血素培育n植物细胞染色体制片技术n前处置-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片。